报告基因

2017-09-13 13:01:10盛世华康生物医药科技有限公司

报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件（如启动子、增强子和沉默子等）。它具有便捷、可靠、灵敏度高和适用于大规模检测等优点。目前已发展的多种报告基因：氯霉素转乙酰酶、 β-半乳糖苷酶、荧光素酶以及荧光蛋白等。

定义及本质

报告基因（reporter gene）是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因，其与目的基因融合后的表达产物可用来标定目的基因的表达调控。报告基因的基本单元包括启动子和报告基因两个密不可分的部分，其中报告基因编码易检测蛋白或酶，而启动子则调控序列表达。是和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具，在解析基因时空表达调控的内在规律中发挥着重要作用。

分类

1. 氯霉素乙酰转移酶基因

氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因最早应用于检测哺乳动物中的基因表达。作为报告基因，氯霉素乙酰转移酶基因表达产物比较稳定，且在活性很低的水平就能被检测出来。CAT 能催化氯霉素乙酰化反应，将乙酰基从乙酰辅酶 A 转移到氯霉素的 3-羟基位上，再通过测量放射性标记的底物实现量化。

2. 荧光素酶

luc是能催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源不同主要分为细菌荧光素酶（BL）、萤火虫荧光素酶（FL）以及以海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是 BL 和 FL。常用的检测荧光素酶的方法有液闪法和光照度计法。随着具有膜透过性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的发现和使用，无需裂解细胞即可检测酶的活性。

3. 荧光蛋白

荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为 20-30 k D的同源性蛋白，包括绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白等。绿色荧光蛋白（GFP）是其中应用的最多的一种，GFP 是一种由 238 个氨基酸组成的单体蛋白质。它具有分子小，荧光稳定，检测方便，而且对活细胞无伤害等优点，成为众多报告基因中的后起之秀，被称为“活细胞的分子探针”。

4. β-半乳糖苷酶基因

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）是大肠杆菌乳糖操纵子中 lac Z 基因的产物，在遗传学、细胞生物学和分子生物学研究中广泛应用于监测和校正转染效率。 β-半乳糖苷酶能催化包括乳糖在内的各种半乳糖苷的水解。

原则及条件

报告基因的选择取决于特定的研究目的以及分析的可行性(敏感性、可信度、可检测性以及动力学性质)，报告基因的稳定性将决定其是否适合转录的动态研究、高通量研究以及在转基因实验中全或无式的基因表达研究。

选择报告基因的原则如下：

1）报告基因的产物和蛋白活性的定量检测方法容易建立，并且快速简便，灵敏度高，重现性好；

2）在被转染的宿主细胞中不存在报告基因产物或类似的内源性物质；

3）报告基因表达率与目的基因转录水平同步。

一般的报告基因需要满足以下几个条件：

1）基因被克隆并且已知全序列；

2）宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；

3）表达产物易被检测；

4 ）报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化；

5）报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。

应用

1. 启动子活性分析

报告基因技术最早主要被用来分析基因上游区域顺式基因元件(如增强子和启动子)的活性。此外，利用这种技术也已经鉴定了一些与雌激素、雄激素、甲状腺素、一氧化氮反应有关的启动子序列和一些与调节基因表达相关的转录因子，而且利用此技术还可以有选择地改变不同基因的表达水平。

2. 基因转移分析

报告基因作为标记物还可被应用于监测基因转移(geenatrnsfer)。最初报告基因技术主要被用于培养的细胞，而近来则更多的用于检测基因在转基因动物和转基因植物中的表达。

3. 信号转导通路的活性检测

信号是如何从细胞表面传递到细胞内、细胞内信号机制是如何受到控制以及不同信号通路间是如何交互作用的都是目前受到众多关注的问题。有人构建了TN一a启动子驱动的荧光素酶报告基因系统，来研究LPS对p38MAPK信号转导通路的激活作用与其诱导TNF一a转录活性的作用，就是这方面应用的一个很好例证。

4. 受体功能鉴定

报告基因技术还可被用于膜受体和细胞内受体的克隆、功能表达及其特性方面的研究，尤其是在研究激动剂或拮抗剂在改变活细胞中受体活性方面的作用上都是很有价值的。

5. 细胞毒性检测

将β-半乳糖昔酶和荧光素酶报告基因共转染细胞，用敏感的比色计和发光计检测系统观察报告基因的表达可用来检测细胞的极性和活力。另外，利用稳定转染报告基因的细胞株进行生物学筛选可以来研究药物的细胞毒性。

6. 生物大分子的相互作用

荧光共振能量转移(fluoerseentersonaneeen，FRET)是指两个有重叠的激发/吸收光谱的不同发光色团，在一个适宜的相对位置及相距时所产生一种能量转移现象。FRET可用快速成像流式细胞仪或激光共聚焦显微镜来进行检测。通过选择两种光谱合适的荧光蛋白，我们就不仅能在活细胞内同时进行不同蛋白质的示踪,还可检测蛋白分子之间或者蛋白分子内部的相互作用。

7. 药物开发的生物筛选

随着分子生物学的发展，越来越多的孤儿受体已经被发现并克隆，其配体和信号转导机制虽然未知，但却有可能成为药物筛选中的新靶标。由于报告基因技术在HST过程中具有较高的可靠性、可重复性、敏感性和适用性，使其更适用于以细胞为基础的体外生化分析。其优点是稳定性好，而且可以提供受体一配体相互作用以及信号转导通路方面的信息，而这用传统的受体配体结合实验和第二信使检测都是无法得到的。此外，报告基因的活性可以在培养的活细胞中保持几个星期甚至更长，这就使我们可以对药物耐药性和副作用的适应性改变做长期观察。

展望

报告基因作为一种有效的技术手段目前已在农学、生物医学、生命科学和环境保护等领域发挥重要作用，它是目的物定位、表达、转移的风向标。随着技术的发展和研究的深入，报告基因种类的增多及检测方法的不断完善，在今后的研究中必将发挥更广泛的作用。