【前沿速递】新策略！病毒基因治疗逆转自身免疫性糖尿病？
【编者按】
1月4日，国际知名专业杂志《Cell Stem Cell》刊登了美国匹兹堡大学医学院Xiangwei Xiao博士及George K.Gittes研究团队的论文。该研究揭示了病毒基因疗法使毒素导致的糖尿病老鼠的血糖正常和自身免疫非肥胖糖尿病（NOD）老鼠上新生的INS+细胞持续了4个月，先于自身免疫糖尿病的重新建立，也诱发了毒素处理的人类胰岛Alpha细胞向Beta细胞的转变并使移植后的NOD老鼠恢复血糖水平,为自身免疫1型糖尿病的治疗策略提供了新的思路。
【研究背景】
因为胰岛素（INS）的缺乏导致的糖尿病，全球影响了超过3亿人。糖尿病治疗的根本目的是保护和恢复一个功能性Beta细胞团（Beta细胞产生胰岛素），可以通过Beta细胞替换疗法。但是，这种方法在自身免疫1型糖尿病（T1D）患者上可能会无效, 由于患者对Beta细胞持续复发的自身免疫。不幸的是，对T1D患者产生更持久Beta细胞团的临床适用策略还未研发。基因疗法从其它细胞类型产生新的Beta细胞可能是必须的。
Pdx1是胰腺发育的一个必要的转录因子，涉及Beta细胞成熟、增殖和活动。MafA是结合到胰岛素启动子以调节胰岛素表达和Beta细胞代谢的一个转录因子。三种关键的胰腺Beta细胞转录因子（Pdx1，Ngn3，MafA）的异位表达已显示可重新编程成年老鼠胰腺腺泡细胞变为Beta样细胞，而且这三种基因的共同过表达已显示可转换Sox9 +肝细胞变为胰岛素产生细胞。胰腺Alpha细胞可能是Beta细胞替换的理想来源，研究者想验证关键Beta细胞转录因子在Alpha细胞的强制表达，是否会引起它的重编程以产生Beta或Beta样细胞。
非一体化腺相关病毒 （AAV）载体可给予长达4.5kb的转基因的长时表达，且AAV载体已发现在转导胰腺细胞上更加有效，比起腺病毒和慢病毒载体。其中，AAV-8显示出对老鼠胰岛内分泌细胞最高的转导效率。本研究中，研究者将携带Pdx1和MafA表达框的AAV通过胰腺管传递给可以谱系追踪Alpha细胞的转基因老鼠的胰腺，来重新编程Alpha细胞为功能性Beta细胞，且使Beta细胞毒素诱导的糖尿病老鼠和自身免疫非肥胖糖尿病（NOD）的老鼠的血糖正常化，并探讨了新生INS+细胞在自身免疫环境中延长生存的机制。
【结果概览】
1.导管内注入PM病毒逆转了毒素在老鼠诱导的糖尿病
首先，研究者检查了Alpha细胞变成Beta细胞的潜在重新编程，通过使用AAV诱导老鼠Pdx1和MafA（两者简称为PM）的表达。
为了允许对Alpha细胞的谱系追踪，研究者首先产生GCG-Cre; R26RTomato报告老鼠（番茄红色荧光明确地在胰腺标记GCG+ alpha细胞谱系）（图1A）。研究者发现四氧嘧啶（ALX）诱发的高血糖症在2周内被矫正，通过导管内注入AAV-PM后，但没有出现在对照组AAV-GFP老鼠上（图1B）。在病毒输入后第4周，四氧嘧啶处理的AAV-PM灌注老鼠的葡萄糖反应有明显的改善（葡萄糖耐量试验）（图1C）。Beta细胞团在接受AAV-PM的四氧嘧啶处理的老鼠上明显增加，与接受AAV-GFP病毒注入四周后的老鼠相比，达到超过60%未处理老鼠的Beta细胞团（图1D）。因此，AAV-PM的导管内注入逆转了老鼠因四氧嘧啶诱发的高血糖症。
Figure 1. Intraductal Infusion of AAV-PM Corrects ALX-Induced Hyperglycemia in GCG-Cre; R26RTomato Mice
2. 再生的INS+细胞主要来源于重新编程的Alpha细胞
进一步，研究者想在INS+细胞群中量化番茄红色+细胞，以每只老鼠计数 5,000个 INS+细胞为基础，每个实验组5只老鼠。用AAV-GFP注入对照的GCG-Cre; R26RTomato老鼠的胰腺，没有INS+细胞被番茄红色标记（图2A）。但是，约 78.9%四氧嘧啶处理的AAV-PM注入的老鼠的INS+细胞被番茄红色标记（图1D，2A和2B），表明一个Alpha细胞的起源。非常少的INS+细胞没有标记上番茄红色（图1D和2A），推测其代表或者源于四氧嘧啶处理后极少数生存的Beta细胞，或者源于没有标记的重编程Alpha细胞。研究者在病毒注入4周后持续地在饮水中给予老鼠溴脱氧尿苷（BrdU），发现约78.5%番茄红色+INS+细胞包含有BrdU（图2C），13.4%±1.6% Ki-67+ INS+细胞被同时检测出（图2D）。从用四氧嘧啶和AAV-PM处理的老鼠分离的胰岛表达出高水平的细胞循环活化剂周期蛋白1（CCND1）和CDK4，及低水平的细胞周期抑制因子p27（图2E-2G）。这些数据表明从Alpha细胞重编程的新生INS+细胞可能会出现明显的增殖。而且，从用四氧嘧啶和AAV-PM处理的老鼠分离的胰岛在葡萄糖刺激的胰岛素的释放上与未处理老鼠的普通胰岛没有不同（图2H）。
Figure 2. Neogenic INS+ Cells Are Derived from Reprogrammed Alpha Cells
为了排除先已存在的Beta细胞可能瞬间去分化且激活GCG启动子，以及在四氧嘧啶和AAV-PM处理后被番茄红色标记的可能性，研究者产生了一个GCGCreERT敲入的老鼠，以制造一个可诱导的Cre 系统(GCGCreERT; R26RTomato) ，用于仅在四氧嘧啶和AAV-PM处理之前谱系标记天然的Alpha细胞（图3A）。在GCGCreERT; R26RTomato老鼠上，研究者发现四氧嘧啶诱导的高血糖症又一次在导管注入AAV-PM的两周内被纠正，但没有出现在AAV-GFP处理的对照组上（图3B）。糖耐量实验和Beta细胞团上的发现在这些老鼠上也重现了（图3C，3D）。以每只老鼠计数 5,000个INS+细胞为基础，每个实验组5只老鼠，研究者发现约95.6% INS+细胞在AAV-PM注入四氧嘧啶处理的老鼠后，被番茄红色标记（图3E），表明一个Alpha细胞的起源。在紧接着的24小时内，这些老鼠仍血糖正常且重新建构的Beta细胞团持久的存在（图3D），仍被番茄红色标记（图3F）。
为确定在较年长的老鼠上Alpha细胞保留了转化为Beta细胞的能力，研究者对GCG-Cre; R26RTomato 老鼠在4个月大时用四氧嘧啶和病毒注入处理。结果显示较年长的老鼠Alpha细胞保留了转化为Beta细胞的能力，以响应Pdx1和MafA表达的激活。
3.Alpha细胞来源的INS+细胞对普通Beta细胞有相似的表达谱
研究者检查了Alpha细胞来源的INS+细胞、普通Alpha和Beta细胞基因表达类型的不同。因此，研究者产生了三重转基因老鼠(GCG-Cre;R26RTomato; MIP-GFP) ，后续实验发现Alpha细胞来源的INS+细胞有一个基因表达类型非常接近于普通Beta细胞，但与最初的Alpha细胞很不同，说明Alpha细胞来源的INS+细胞已经经历了一个接近完全地向Beta细胞的转变。
4.对高血糖NOD老鼠注入AAV-PM导致血糖长时间正常化
研究者检查了是否新形成的INS+细胞会被一个自动免疫的糖尿病免疫系统识别。研究者在老鼠血糖超过200 mg/dL时（即糖尿病发作早期），给予NOD老鼠一个单一PM病毒的导管注入。他们发现血糖过多在这些老鼠上的正常化相当迅速，大约4个月，接受了AAV-GFP 的对照鼠显示血糖持续增加且在5周内死亡。免疫组化分析显示接受了 AAV-PM 的老鼠有明显更大的细胞团作为它们正常化血糖的基础，尽管胰岛炎仍存在（以对免疫细胞的CD45着色为基础）。而且在早期，一些INS+细胞也表达GCG，可能代表在传输中的细胞。电子显微镜图片显示存在同时有INS和GCG颗粒的单个细胞，表明这些INS产生的细胞是从Alpha细胞重编程的。
5.病毒治疗后评估NOD免疫系统的状态
众所周知，胰岛移植于一个自动免疫的糖尿病环境可以通过“快速复发的”免疫攻击的形式被快速破坏，即使这个病人对一个肾的移植是充分地免疫抑制。新生的INS+细胞对这种“快速复发的”自身免疫的抵抗的一个合理解释是AAV-PM注入胰腺导管在某种程度上可以直接改变NOD老鼠的自身免疫，导致新生INS+细胞生存的延长。这个可能性看上去不可能，因为对照组AAV-GFP的注入没有给Beta细胞以保护。
为进一步检查此可能性，研究者在病毒注入4周后分离了AAV-PM处理的NOD老鼠的脾细胞，且对NOD老鼠执行一个适应性转移。从未处理的高血糖NOD老鼠和用AAV-GFP处理的NOD老鼠得到的脾细胞用作对照，两者之间没有明显不同。研究者发现糖尿病在NOD老鼠上的发展，在接受了用AAV-PM处理的NOD老鼠的脾细胞之后，出现一些延迟，但仍存在。
为进一步验证老鼠自身免疫的能力，NOD老鼠的胰岛在病毒注入的4周后，被移植在用AAV-PM和AAV-GFP 处理的NOD老鼠肾包膜下，也移植在未处理的老鼠上作为对照。研究者发现与AAV-GFP处理的NOD老鼠相比， AAV-PM处理的老鼠上检测到稍高的移植INS容量和较高的INS+细胞数（但仍低于对照组很多）。肾包膜移植物的胰岛素的免疫组化实验进一步确证这个结果。这些数据进一步说明NOD老鼠的自身免疫是完整无损的，且在移植时它表现得就像没有活跃地暴露于Beta细胞抗原一样，因此对移植的胰岛表现出一个轻微的延迟反应。
6.AAV-PM诱导人类胰岛Alpha细胞产生功能性的INS+细胞
以这些老鼠的研究数据为基础，研究者想验证是否人类Alpha细胞可以通过相似的策略被重编程变为功能性的INS+细胞。
研究者用 20 mmol/L 链脲佐菌素处理人类胰岛12小时以破坏Beta细胞，然后在试管内用AAV-PM或 AAV-GFP处理这些胰岛24小时以引起Alpha细胞到Beta细胞的转变，然后移植于四氧嘧啶处理过的高血糖NOD老鼠。链脲佐菌素的Beta细胞毒效应通过检查每个胰岛的INS容量来确证。在链脲佐菌素和AAV-PM处理培养物3天后，INS和GCG双阳的细胞被检测出。在链脲佐菌素和AAV-PM处理培养物3天后，Alpha细胞团在人类胰岛增加了35%。移植的一周内，接受链脲佐菌素和AAV-PM处理的人类胰岛移植后的高血糖NOD老鼠表现出显著更低水平的血糖和更好的血糖容忍曲线，与链脲佐菌素和AAV-GFP处理的老鼠相比。移植4周后，移植物被收获，研究者在AAV-PM处理的人类胰岛移植物上发现一个明显更高的INS容量，更大的Beta细胞团和更高的人类血清C-肽，比起用AAV-GFP处理的人类胰岛移植物，这被免疫组化实验进一步确证。在胰岛移植后，用BrdU持续地标记了一周，只有1.5% ± 0.3% 的INS+细胞包含了BrdU。
这些数据说明AAV-PM能诱导人类胰岛Alpha细胞产生功能性的INS+细胞，尽管研究者不能排除人类非Alpha细胞或非Beta细胞也可能造成INS+细胞增多。
【存在缺陷】对老鼠糖尿病的改善只持续了4个月，而不是终身。
【未来工作】
1. 优化一个高效、高度特异的、更小的GCG启动子构建，以适于进入AAV载体。
2. GCG启动子长度的增加可能是必需的，以允许转基因的充分表达。
【小结】该研究将携带Pdx1和MafA表达框的腺相关病毒通过胰腺管注入转基因老鼠的胰腺，将Alpha细胞重新编程为功能性Beta细胞，且使Beta细胞毒素诱导的糖尿病老鼠和NOD老鼠的血糖正常化，为自身免疫1型糖尿病的治疗策略提供了新的思路。
本期撰文及编辑：乌龟
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