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带你走进基因敲除小鼠的一生

2017-06-01 14:32:34邦耀实验室

导读
在上一篇文章中,我们已经了解到,基因编辑小鼠主要分为基因敲除(KO)、条件性敲除(CKO)及基因敲入(KI)等几种方式。其中基因敲除鼠(KO)是基因编辑鼠中最常用、也是最容易构建的模型鼠,但是这样一种模型鼠的设计和构建过程依然复杂。本文就以CRISPR/Cas9技术为例,为大家科普一下基因敲除鼠的设计、构建、鉴定与使用方法。


基因敲除原理
 


早期基因敲除主要利用DNA的同源重组原理,通过ES细胞打靶技术,设计同源片段代替靶片段。而近期热门的CRISPR/Cas9技术,通过人工优化的具有定位作用的单链引导RNA(single Guide RNA,sgRNA)引导核酸酶Cas9蛋白在与sgRNA配对的靶位点处剪切双链DNA,引起DNA双链断裂(DSB),进而利用生物体内非同源末端修复机制(NHEJ)或同源重组机制(HR)修复DNA,导致基因移码突变、替换或删除,致使基因功能丧失。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物,并能稳定遗传。

图1. 基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除原理


 

下面就为大家介绍一下基于CRISPR/Cas9技术基因敲除鼠的构建。
 


 

基于CRISPR/Cas9技术基因敲除鼠的构建过程就如下图所示:

主要包括其中,gRNA设计和筛选,sgRNA表达载体构建,显微注射,胚胎移植,小鼠培育及繁殖及小鼠基因型鉴定等过程。详情请点击(基因编辑鼠的构建)

图2.   基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除鼠构建图


 

sgRNA设计及表达载体构建


 

其中,sgRNA的设计是通过在目标基因N端编码序列中寻找合适的靶序列完成的,可以利用软件(sgRNA Designer)预测潜在sgRNA序列。经过在http://crispr.mit.edu/网站上脱靶率预测后,在细胞中进行活性筛选后,取脱靶率较低的sgRNA构建打靶载体。随后将上述sgRNA与Cas9-mRNA一起注射入体外受精小鼠受精卵的胞浆部分,并将之移入假孕母鼠体内发育为子代小鼠。


 

小鼠基因型鉴定


 

胚胎移植后的小鼠约19天后出生,取子代小鼠的基因组DNA进行基因型鉴定,即所谓的Founder,F0代。基因鉴定一般利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR),即利用引物大量扩增目的片段。一般我们会选取目的片段上下游200-300bp长度的序列作为引物设计的对象。


 

如果缺失的DNA片段有成百甚至上千个碱基,这样可以通过PCR产物长度来区分突变型和野生型小鼠基因型,较长即为未敲除片段,较短则为已敲除片段;


 

如果缺失为几bp或者几十bp 无法通过PCR电泳图来区分野生型和突变型,那么需要进一步通过T7E1酶切或者测序的方法进行区分。如下图所示:


 

基因敲除纯合子(-/-):只带有已敲除片段的小鼠为纯合子;

基因敲除杂合子(+/-):同时带有已敲除和未敲除片段的小鼠为杂合;

野生型小鼠(+/+):只带有未敲除片段;


 

注:也可以将PCR结果送测序以进一步确定。


 

图3.  PCR结果示意图


 

详情请点击(基因编辑小鼠——基因型鉴定)


 

小鼠交配与使用方案设计


 

通过对出生的小鼠进行鉴定,一般可以获得F0代基因突变鼠。待F0代小鼠性成熟后将其与具有相同突变类型的小鼠进行交配,可获得具有稳定突变的F1代纯合小鼠。如下:
 


 

基因敲除杂合鼠(+/-)与另一只杂合敲除鼠(+/-)交配,基于基因分离定律,其后代中纯合敲除(-/-),杂合敲除(+/-),野生型(+/+)的比例大致为1:2:1。通过基因鉴定,留下纯合敲除鼠即可稳定繁殖。

当然也可以大量获取基因敲除杂合鼠,实验前令其与另一批杂合鼠交配,通过基因鉴定留下子代纯合敲除鼠与子代野生型鼠作为实验材料。


 

图4.  杂合子小鼠交配基因分离示意图


 

小鼠分组


 

一般实验分组分为实验组(基因敲除鼠)与对照组(野生型),实验组就是基因敲除鼠(一般为纯合子);而野生型则是具有相同遗传背景的鼠,可以是基因分离中留下的野生型鼠繁育得到,也可以是同品系野生型小鼠。


 

如药效检测实验,或是引入另一种改变小鼠性状的因素,则可以设计实验分组如下图所示:


小鼠只数


 

每组的小鼠只数尽量保证一致,一般每组5-8只比较合适。具体只数则可以参考同行的经验。


 

如以邦耀实验室团队2016年发表在EMBO Molecular Medicine上: CRISPR/Cas9技术改善小鼠血友病的文章为例[1]。研究选取了10只或以上成年鼠取用于检测基因修复后的存活率;选取了5只或以上成年鼠用于验证信号通路、分子机制。


 

又例如Volker Haucke等人于2017年发表在PNAS上,研究ITSN1基因敲除对小鼠大脑的影响的文章中[2],选取了7只或以上成年鼠进行实验,而较复杂的实验则选取4只。由此可见,如果条件允许,实验鼠选取8只左右是比较适宜的,研究修复作用或功能影响的可以多一些,以降低个体差异;而较难完成的实验则可以稍少一些,保证4只以上即可。


 

小鼠性别及年龄


 

实验一般选雄性小鼠,年龄控制在相近的时间段,一周之内最佳。一般实验会选用成年鼠,即3月龄的小鼠。如研究发育,则会按照发育过程相应的时间阶段选鼠,具体需要借鉴已发表的文献。


 

小鼠后续保种


 

基因敲除小鼠得来不易,如果顺利构建一只基因敲除鼠就需4-6个月,可见周期的冗长。因此,在实验结束后一般会将这些基因型小鼠长期保存下来方便后面使用,常见的方式有冷冻精子和胚胎,它们与单纯饲养活体动物保存种质资源相比,可以大大降低饲养动物所占用的经费、时间和空间,同时可避免饲养过程中基因的丢失。


 

作为协助及提供科研解决方案的生命科学实验室,邦耀实验室基于基因编辑技术平台,已经成熟掌握利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除大小鼠,获得Founder仅需2-3月,获得稳定遗传的F1代最快仅需4个月,可以高效靶向地为您提供优质的模式动物技术服务。

 

参考文献:

1. Guan Y, Ma Y, Li Q, Sun Z, Ma L, Wu L, et al. CRISPR/Cas9‐mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse. EMBO Molecular Medicine. 2016;8(5):477-88.


 

2. Jakob B, Kochlamazashvili G, Jäpel M, Gauhar A, Bock HH, Maritzen T, et al. Intersectin 1 is a component of the Reelin pathway to regulate neuronal migration and synaptic plasticity in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2017:201704447.