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基因治疗的历史与趋势

2019-02-04 08:01:48行研园地

基因治疗概念

基因治疗(gene therapy)是指利用分子生物学方法将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞或组织中,以纠正或补充因基因缺陷和异常所引起的疾病,是一种根本性的治疗策略。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因,也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位,以替代缺陷基因来发挥作用。

基因是携带生物遗传信息的基本功能单位,是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体,基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。

基因治疗主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病,包括:遗传病(如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)。基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。

基因治疗与常规治疗方法不同:一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状,而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式:一是体细胞基因治疗,正在广泛使用;二是生殖细胞基因治疗,因能引起遗传改变而受到限制。

体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞,使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。因此干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以如今的观点看,骨髓胞是唯一满足以上标准的靶细胞,而骨髓的抽取,体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟;另一方面,骨髓细胞还构成了许多组织细胞(如单核巨噬细胞)的前体。因此,不仅一些涉及血液系统的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等以骨髓细胞作为靶细胞,而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也都以此作为靶细胞。除了骨髓以外,肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。

 

基因治疗原理

在生物体内,遗传信息沿着“DNA-RNA-蛋白质”的方向逐级传递(中心法则),蛋白质是遗传信息的表现形式,因此疾病发生时多表现为蛋白质层面的异常。目前绝大多数的药物均以蛋白质为靶点,如治疗肿瘤的小分子靶向药物和大分子单抗药物,通过改变蛋白质的功能来治疗疾病。

基因治疗则是从蛋白质的上游——DNA入手,通过调控DNA来改变遗传信息传递,进而改变蛋白质的性状,实现从源头上治疗疾病。此外,也有少部分药物,如小核酸药物Patisiran,以RNA为靶点对疾病进行治疗,从广义上来说这类药物也属于基因治疗的范畴。 

  

1:中心法则示意图

资料来源:华金证券研究所整理

 

根据中心法则,每一个生理过程都可以理解为特定的基因在特定的时间和空间里发生特定强度表达的结果,如果这种平衡被打破就会诱发疾病。从这个角度看,几乎所有疾病的发生都可以在 DNA 水平进行解释,这也是基因治疗的理论基础。

根据基因变异类型的不同,导致疾病发生的基因异常大致可分为两类:(1)基因突变导致基因指导合成的蛋白质功能异常,表现为蛋白质没有功能、功能变弱或功能过强,甚至产生有害蛋白;(2)基因表达强度异常,表现为不该表达的基因表达、应该表达的基因不表达、基因表达的强度过高或过低等。因此,从理论上来说基因治疗几乎可治愈绝大多数的疾病。然而,疾病的发生往往涉及多个基因,对应的蛋白质之间的相互作用形成了一个庞大的调控网络,仅对某一个或几个基因进行调节难以达到治疗疾病的目的。此外,科学家对人体基因功能和疾病发生机制的研究仍然非常有限,存在大量未被发现的新基因和信号网络。基因和疾病太多的不确定性极大地限制了基因治疗的应用领域,故而基因治疗目前只适用于少数致病机制或治疗方案非常明确的疾病,如单基因遗传病、肿瘤等。

 

基因治疗发展史

20世纪60~70年代

1963年,美国分子生物学家、诺贝尔生理学或医学奖获得者Joshua Lederberg第一次提出了基因交换和基因优化的理念,为基因治疗的发展奠定了基础;

1970年,美国医生Stanfield Rogers试图通过注射含有精氨酸酶的乳头瘤病毒来治疗一对姐妹的精氨酸血症,这是首例人体试验,试验以失败告终。

1971年,一项重要的科学实验表明,DNA可以注入人体细胞,解决细胞中的生物学问题。DNA恢复了从患有半乳糖血症的患者中提取的人成纤维细胞缺失的酶活性。值得注意的是,外源DNA处理的仅仅是在培养皿中生长的细胞。

但事实上,相比体内,体外操纵人体细胞的遗传容易得多。在过去的50年里,采取下一步措施为人类提供有效的基因疗法一直是一项重大挑战。

1972年,一篇发表在Science的文章中首次正式提出使用基因疗法作为治疗人类遗传疾病的手段。受到1971年结果的启发,作者Friedmann和Roblin表示,“基因疗法可能在未来改善人类的某些遗传疾病 ”。他们希望“基因疗法仅在那些证明有益的情况下用于人体”,并且不会因为过早使用而被滥用。

20世纪80年代

Martin Cline和French Anderson等科学家正在研究如何使用病毒将DNA传递到小鼠或人细胞中。最初,这些细胞在体外进行遗传修饰。

首次在临床试验中使用基因疗法的尝试始于20世纪80年代后期。直到20世纪90年代初才开始报告这些试验。

20世纪90年代

1990年,被称为“基因治疗之父”的William French Anderson医生领衔进行了一项长期临床试验,治疗患有腺苷脱氨酶(ADA)缺乏性重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)的儿童。使用逆转录病毒将ADA基因转移到分离的T细胞中,然后将这些基因修饰的T细胞回输至患者体内,以求向ADA-SCID患者中引入健康的ADA基因。令所有人高兴的是,临床试验观察到儿童健康状况的显著改善。

该报告表明,基因治疗可以安全有效地用于病人。

自此,基因治疗研究在1990年代陆续进行,10年间开展了上千例临床试验。在这期间,大部分工作都集中在治疗ADA-SCID患者。1992年,意大利科学家首次成功地使用逆转录病毒修饰造血干细胞,将全序列ADA基因传递给ADA-SCID患者。

截至此时,NIH(国立卫生研究院)和FDA(食品和药物管理局)都非常谨慎,但支持这项基因治疗工作的发展。

然而,这种情绪在1999年因基因治疗引起的首例患者死亡而发生了变化。

18岁的Jesse Gelsinger患有鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷(OTC),1999年,他参与了一项由宾夕法尼亚大学开展的临床试验,研究人员用腺病毒将缺失的基因传递到他体内。4天后,Gelsinger死于强烈免疫反应导致的多器官衰竭。

首例受试者的死亡给基因治疗发展史蒙上了一层阴影,同时也是一个警醒,提醒人们注意风险。FDA随即暂停了几项基因治疗临床试验。

2000年,法国内克尔医院研究组利用逆转录病毒感染造血干细胞成功治疗X-连锁重症联合免疫缺陷症(X-SCID)。但在3年后,其中5例受试者发展成白血病,其中1位因此死亡,后来发现诱发白血病是由于逆转录病毒在基因组中的随机插入激活了癌基因的表达所致。

2003年,FDA暂时中止了所有使用逆转录病毒来改造血液干细胞的临床试验,但经过3个月严格审核权衡后,才允许基因治疗临床试验继续进行。

21世纪~至今

这十几年中,基因治疗继续向前迈进。值得注意的是,FDA(美国食品和药品管理局)和EMA(欧洲药品管理局)已经批准了一部分基因疗法。

2012年,EMA批准了首款基因疗法Glybera,一种携带人脂蛋白脂肪酶(LPL)基因的AAV1载体,用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏引起的严重肌肉疾病,售价高达120万美元。就在去年,由于销售情况堪忧,uniQure公司宣布其在2017年10月Glybera的销售许可证到期之后不再重新申请,黯然退市。

这对制药行业来说是一个苛刻的教训。截至目前,基因疗法的定价对政府、药企和相关机构仍是一个难题。

2016年,EMA批准了第二款基因疗法Strimvelis,一种治疗ADA-SCID患者的干细胞基因疗法。ADA-SCID是一种罕见疾病,每年在欧洲影响约14人。与Glybera相似,这种基因治疗起步不好。该疗法最初定价为66.5万美元,这是相当昂贵的。截至2017年,只有2名患者接受了这种治疗。

2018年4月,葛兰素史克(GSK)已将其出售给Orchard Therapeutics。在销售点,只有5名患者接受治疗(价格为73万美元)。

2017年,FDA批准了首款基因疗法Luxturna,一种携带RPE65基因的AAV2载体,治疗罕见遗传性视网膜病变造成的视力丧失,由美国Spark Therapeutics研发。

相关产品批准也意味着,欧洲和美国的监管部门已经对基因疗法持肯定态度,这很大程度上也取决于基因治疗产品的有效性和安全性的进一步提高。

从全球范围来看,目前获批的基因治疗产品主要有以下:

1:全球范围内获批的主要基因治疗产品

药品名

公司

上市时间

上市国家

适应症

癌症领域





Kymriah

诺华

2017

美国

1)B细胞前体急性淋巴性白血病(ALL);2 ) 复发或者难治大B 细胞淋巴瘤

Yescarta

Kite  ( 现已被Gilead 收购)

2017

美国

复发 / 难治性大 B 细胞淋巴瘤

Imlygic

安进

2015

美国

黑色素瘤

Rexin-G

Epeius

2007

菲律宾

实体瘤

Oncorine

上海三维生物技术有

限公司

2005

中国

鼻咽喉 &头颈癌症

Gendicine

深圳赛百诺基因技术

有限公司

2004

中国

头颈癌症

非癌症领域





Luxturna

Spark  Therapeutics

2017

美国

RPE65  基因突变相关的眼部罕见病

Glybera

uniQure  & Chiesi

2015

德国

脂蛋白脂酶缺乏症

Neovasculgen

Human  Stem Cell Institute

2012

俄罗斯

末梢血管病& 肢体缺血

 

资料来源:Pharmaprojects;注:欧盟把Imlygic列为一款基因治疗产品,但是美国FDA不认为这是一款基因治疗产品

 

基因治疗的趋势与当前进展

CAR-T细胞

自2012年开始,全球新增基因治疗临床试验754例。其中最引人注目的领域当属利用CAR-T细胞靶向肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤的免疫治疗。这一方案已受到广泛关注,在许多其他肿瘤治疗方案已经失败的情况下它能够汇聚细胞毒T细胞的杀伤潜力和持久性与单克隆抗体的特异性以杀伤肿瘤。从2011年新英格兰医药杂志报道了一例病人接受转导了能够表达B细胞特异性抗原CD19的自体T细胞输注后达到完全缓解后,已有数百名患者在多次试验中接受了CAR-T 19 这一激动人心的治疗方式,在患有白血病或淋巴瘤尤其是急性淋巴白血病的患者中达到了前所未有的缓解率。这一疗法走向临床成为“免疫疗法”,被科学杂志评为2013年的突破性进展。值得注意的是,到2017年5月,Emily Whitehead 作为首个在费城儿童医院接受CAR-T细胞治疗的儿科患者已经5年没有复发,并且首个CAR-T细胞产品-Kymriah也在2017年被FDA批准上市。靶向实体瘤如胶质母细胞瘤是目前治疗中的一大挑战,相关报道正日益增加。

Cellectis正致力用TALEN技术编辑健康人来源的T细胞嵌合抗原受体(CAR),以利用健康人的血液获得“现成”的免疫疗法产品。这一通用CAR-T的临床试验于2017年2月获得FDA的批准,但由于出现受试者死亡案例,于2017年9月被FDA叫停。患者的死因指向了治疗靶点CD123的选择,而并不在于对“通用型”CAR的免疫反应,因两名患者均未报道有GvHD移植物抗宿主反应。目前这款通用型CAR-T的研发仍然处于不确定状态,但利用健康人血开发“通用”的肿瘤免疫疗法对于免疫力低下而无法在自身血液中获得足够的T淋巴细胞的肿瘤患者而言仍是一个重要的发展方向。

如今,美国已将CAR-T疗法纳入医保,FDA也批准了全球首款CAR-T疗法Kymriah的第二个适应症——复发或难治性大B细胞淋巴瘤。好消息仍在不断传来,cell杂志报道了一款SUPRA CAR-T。SUPRA CAR-T将T细胞从系统的靶点感知部分(the target-sensing portion of the system,SUPRACAR-T系统中用于识别癌细胞上靶点的抗体部分)分离了出来,使系统拥有了切换靶点的能力。这一款通用型CAR-T是一种分离的、通用、可编程式(split,universal, and programmable,SUPRA)CAR系统,用于T细胞治疗。能够很好地调控T细胞激活程度以消除毒性;能够感知多种抗原并做出响应以对抗癌症复发;还诱导控制细胞类型特异性的信号。这一系统的出现有望提供更安全、更有效的癌症治疗。

单基因遗传病

单基因遗传病在治疗方面有了极大的稳步进展。截止2017年11月,11.1%的临床试验集中在单基因遗传病领域,而其在2012、2007和2004的历史数据分别为全部试验的8.7%、8.3%和9.8%。

非病毒载体

在囊性纤维化的治疗中,非病毒的基因治疗能够改善肺功能的概念已经一个随机的、双盲、安慰剂对照的临床IIB期试验验证。这一试验中,78例患者接受了阳离子脂质体包裹的编码CFTR cDNA的质粒DNA的转导。尽管收效甚微并且仅在个别受试者身上起效,但这一试验证明了其安全性并为未来试验的改进如增加剂量和频次打下了基础。

γ-逆转录病毒载体

针对免疫缺陷的临床试验仍在继续显示其显著的临床效果,超过150例合并缺陷患者接受了γ-逆转录病毒和最近基于慢病毒的基因转移治疗。在腺苷脱氨酶缺乏症(ADA-SCID)的治疗方面,超过40例患者接受了治疗,疾病的存活率超过70%。值得注意的是,Struimviv(葛兰素史克公司),基于里程碑式的米兰试验已于2016年获得了欧洲市场授权局(EMA)的市场批准,代表了第一个靶向干细胞的的基因治疗体外方案在欧洲获批。尽管经过长期的追踪在ADA-SCID的治疗中并没有观察到与载体的基因毒性相关的不良事件,但使用慢病毒进行治疗的临床试验逐渐增多。使用慢病毒对原发性免疫缺陷如X连锁重症免疫缺陷(X1-SCID)和Wiskott-Aldrich的治疗也有报道,并显示出相对于γ-逆转录病毒载体更好的安全性。

慢病毒载体

慢病毒载体在靶向造血干细胞治疗遗传性神经疾病ALD和异染性白质营养不良中的应用也取得了可喜的成果,并且类似的方法也被用于血红蛋白病的治疗,包括镰状细胞病患者的早期报道。在蓝鸟生物赞助的一项试验中,治疗后15个月,镰状球蛋白β抗体的水平约为β球蛋白的一半,疾病表征也得到了纠正。β地中海贫血的基因治疗,尤其是那些还残存β球蛋白表达的病人的治疗报道也令人充满希望,全球范围内目前已经开展了六项临床试验。2018年4月19日新英格兰医学杂志发表了哈佛医学院Leboulch等研究组用BB305载体转导的自体CD34 +细胞的基因治疗减少或消除了对22名患有严重β地中海贫血的患者长期红细胞输血的需要,而没有与药物产品相关的严重不良事件。这一里程碑式的试验成功新英格兰医学杂志的给予了高度赞赏,出版了专门的点评文章。目前世界上关于地中海贫血的基因治疗还有两项临床试验正在进行中。由Meorial Solan Kattering医院主导的临床试验使用了相对温和的清髓预处理方法,也获得了与哈佛医学院相似的满意结果,而国内的地中海贫血基因治疗试验正在广州南方医院进行。

AAV载体

基于腺相关病毒(AAV)载体的治疗也在临床相显现了令人印象深刻的结果,这反映在一些专门的基因治疗期刊中关于这一载体系统的特征性讨论中。在这些试验中值得关注的包括α-1抗胰蛋白酶缺乏症、血友病A和B以及眼科疾病的基因治疗。用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症的AAV载体在2012年获得EMA批准后已被uniQure公司市场化为Glybera。而美国第一个基于AAV的基因治疗产品voretigene neparvovec被Spark命名为Luxturna,获得了FDA咨询委员会的一致认可。该产品将人视网膜色素上皮特异性蛋白65 kDa(RPE65)cDNA递送到双眼视网膜下间隙治疗视网膜营养不良。在2017年10月19日,FDA授予了Luxturna的正式批文。

自2012年以来,血友病B(凝血因子IX缺失)的第二例临床试验已由A C Nathwani和其同事发起(皇家自由医院)。在该试验中,使用了血清型AAV8的病毒外壳以期比之前试验中使用的AAV2获得更高的基因表达率。关键的是AAV8较之AAV2在人群中的预存抗体水平更低。该实验中,外周静脉一次性注射表达凝血因子IXcDNA的由肝脏特异性启动子启动的AAV载体,能够将血浆中凝血因子IX水平提升至治疗水平(正常水平的1-6%),这一水平提升呈现剂量依赖性。高剂量注射能够观察到短暂的转氨酶水平升高,随后经皮质类固醇治疗好转。更多的血友病B的I/II期临床试验使用了天然存在的Padua亢进突变体进行。在这些试验中,在两个接受了高剂量载体注射的患者体内观察到了免疫反应导致的转基因表达下降,其中一个病人需要转向传统的凝血因子IX注射治疗,而且从另一方面来讲,尽管在10个受试者中观察到两个肝酶水平无症状的增加,但能够通过短期皮质类固醇治疗来解决。AAV9血清型的重组AAV病毒藉治疗神经性脊髓型肌萎缩症(SMA)162型和圣菲力波综合征A型(MPS IIIa)走向临床,说明这种病毒能够有效地跨越人的血脑屏障,在小鼠模型中也获得了一致的结果。