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生物医药的专利江湖之:基因编辑的世界

2017-06-23 08:46:43生物制药小编

自2012年CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)技术作为一种新的基因编辑技术被首次报道后,在短短数年中就带来了专利申请量和相关论文发表量的激增,这将基因编辑技术再次推向了公众的视野。2012年TALEN(Transcription Activator-Like Effector-based Nuclease)作为一种基因编辑技术就曾入选Science杂志的年度十大科学突破之一,而2015年CRISPR-Cas9基因编辑技术又当选了Science杂志的年度十大科学突破之首,这些都见证了基因编辑领域的迅速发展。下面这篇小文我们来共同了解下什么是基因编辑以及保护各种主流基因编辑技术的代表性专利。

 


 

生物医药的专利江湖

基因编辑的世界

by木桃

什么是基因编辑?

简单来讲,基因编辑就是一种使用工程化核酸酶或“分子剪刀”在活体基因组中插入、切除或替换DNA的方法。这些核酸酶可以在基因组的特定位置产生位点特异性双链断裂(Double strand break,DSB),然后通过非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源定向重组修复(Homology directed recombination repair,HDR)的方式进行修复,从而实现靶向基因编辑。基因编辑可以帮助人们探索基因的功能或者修复受损/突变的基因,从而用来构建疾病模型,甚至治疗疾病。

工程化核酸酶的四大家族

工程化核酸酶有四大家族,它们分别是: 1)归巢核酸内切酶,也称为兆核酸酶或大范围核酸酶(Meganuclease); 2)锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN); 3)转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector-based nuclease,TALEN); 和 4)规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)。

按照它们识别靶DNA的方式又可以分为两大类: 1)通过蛋白质-DNA相互作用结合特定DNA的核酸酶(包括归巢核酸内切酶、ZFN和TALEN);以及 2)通过与靶DNA间的碱基配对和蛋白质-DNA相互作用来靶向特定DNA序列的核酸酶(例如CRISPR系统)。

那么,这四大家族的核酸酶之间有何异同?又各自有什么特点呢?

归巢核酸内切酶(Meganuclease)

这是一种以较长识别片段(具有14至40个碱基对的双链DNA序列)为特征的核酸内切酶,其中LAGLIDADG家族应用最为广泛,主要存在于真核细胞生物体的线粒体和叶绿体中,包括I-SceI、I-CreI和I-DmoI等。归巢核酸内切酶比其它天然存在的限制性内切酶具有更高的特异性和更低的细胞毒性,其局限性在于归巢核酸内切酶的种类有限,采用蛋白质工程的方法可以克服这个局限性。已有报道表明该技术有可能修复“着色性干皮病”中发生突变的基因。

归巢核酸内切酶技术,图片来源:Boston Consulting Group Review

锌指核酸酶(ZFN)

这是一种将DNA结合结构域融合到非特异性的DNA切割结构域而产生的经人工改造的限制性内切酶。锌指核酸酶识别不同DNA序列的机理在于组成其锌指蛋白的基元种类及排列方式。单个ZFN的DNA结合结构域通常含有三至六个锌指蛋白基元,可以识别9至18个碱基对。DNA切割结构域由FokI内切酶构成,负责DNA的催化分解。FokI需要形成二聚体才具有酶切活性,因此两个单独的ZFN需要结合在不同的位置并且相隔一定的距离才能实现切割。一个突出的问题是脱靶效应,也就是说,核酸酶并没有对预先设定的目标DNA序列进行识别和切割,而是识别了不相干的位点,造成了“误切”。

ZFN技术,图片来源:Kim JS. Genome editing comes of age. Nature Protocols. 2016 Sep 1;11(9):1573-8.

转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)

这也是一种经人工改造的核酸内切酶,同样是将DNA结合结构域融合到DNA切割结构域制备而成。其中切割域和锌指核酸酶的切割域类似,均为FokI 内切酶;TALEN 的结合域是经过人工改造的TALE蛋白,来源于黄单胞杆菌(Xanthomonas)。与锌指核酸酶类似,TALEN也是根据靶标位点两侧的序列设计一对TALEN,结合到对应的识别位点后,两个FokI单体相互作用形成二聚体,对靶标序列进行切割,从而实现基因修饰。TALEN结合结构域包含一系列高度保守的长度为34个氨基酸序列的重复单元(单体,Monomers),但是在第12位和13位的两个氨基酸是可变的,被称为可变的双氨基酸残基RVD(Repeat Variable Di-residue),正是这两个氨基酸决定了TALEN结合DNA上核苷酸的种类。DNA的四种不同碱基都有与之对应的TALEN识别单元,所以在构建TALEN人工核酸酶时只需将不同的TALEN识别单元按目标序列的顺序连接起来,再与FokI酶的编码序列融合即可完成。TALEN相比于ZFN来说,具有效率高、特异性高和构建过程简单的优势,但也存在着脱靶现象,而且成本也比较高。

TALEN技术,图片来源:Kim JS. Genome editing comes of age. Nature Protocols. 2016 Sep 1;11(9):1573-8.

CRISPR-Cas(CRISPR-CRISPR associated)系统

这个近年来蹿红的技术利用的其实是细菌和古细菌用来抵抗外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。CRISPR是由细菌DNA上一系列特殊的间隔区(Spacer)隔开的重复序列。所谓特殊的间隔区实质上是先前感染的外源DNA(如:病毒或质粒)片段。当这些外源DNA再次入侵时,CRISPR-Cas系统首先产生与靶标序列对应的RNA序列,与入侵的病毒或质粒DNA进行互补结合,然后引导Cas内切酶对入侵DNA序列进行双链切割。Cas9(CRISPR associated protein 9)是Cas基因家族中被研究得比较深入的一种核酸内切酶,而CRISPR-Cas9也成为目前应用最广泛的一种基因编辑系统。在实际应用时,只需将人工合成的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)与Cas9核酸酶的复合物递送到细胞中,就能在特定的位置实现对细胞基因组的切割。CRISPR-Cas系统相对于其它基因编辑技术的优势在于高效率、高特异性和低成本。此外,该系统的载体构建过程简单且廉价,使用门槛较低,因此广受青睐。此外,CRISPR-Cas的独特性还在于可以同时靶向多个位点(即所谓的多路复用,muitiplexing),目前也有报道称该技术也存在着脱靶现象,但是目前的实验数据有限,还不足以支持得出确切的结论。

CRISPR-Cas9技术,图片来源:Kim JS. Genome editing comes of age. Nature Protocols. 2016 Sep 1;11(9):1573-8.

我们在下表中尝试对上述四大家族的技术特点进行了比较:

四种基因编辑技术的特点比较,表格来源:Cox DB, Platt RJ, Zhang F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature medicine. 2015 Feb 1;21(2):121-31.

基因编辑的专利世界

归巢核酸内切酶

说起这第一大家族的专利霸主,非Cellectis莫属

Cellectis自1999年开始研究基因编辑技术,归巢核酸内切酶最初是其优势技术之一,不过公司近几年调整了研发重点,因此相关专利申请主要集中在早期阶段。归巢核酸内切酶的应用难点在于对归巢核酸内切酶进行改造,以获得不同特异性的酶,而Cellectis的专利申请也体现了这一点。

Cellectis递交的相关专利申请主要对归巢核酸内切酶的不同变体和制备方法进行了保护,并且在欧洲、美国和中国都递交了专利申请。

涉及这第一大家族的其它专利大户还包括Bayer CropScience和Precision Biosciences。其中Bayer CropScience的专利申请主要针对利用归巢核酸内切酶对DNA序列进行编辑的方法,并侧重在植物细胞中的应用,而Precision Biosciences递交的专利申请主要针对重组的归巢核酸内切酶和用其进行基因编辑的方法。

我们尝试在下表中总结了涉及这第一大家族的代表性专利及专利申请。

围绕归巢核酸内切酶的部分专利申请.

ZFN

ZFN技术的代表性玩家包括Sangamo BioSciences和Dow Agrosciences,其中Sangamo BioSciences占绝对优势地位

Sangamo BioSciences是一家致力于基因治疗的公司,其优势技术是ZFN技术,不过它也发展TALEN和CRISPR技术。Sangamo对于其核心ZFN技术在不同国家(包括中国)递交了多件专利申请,按照时间顺序来看,这些专利的保护主题涉及ZFN融合蛋白、基因修饰的方法、基因修饰的细胞、基因修饰细胞的筛选和基因修饰的治疗用途等,可见Sangamo的专利申请与其研发过程和产品管线紧密结合,从而构筑起了围绕ZFN技术的专利壁垒

目前,Sangamo BioSciences已有三款基于ZFN介导的体内基因疗法的候选药物处于临床Ⅰ期阶段,分别用于治疗血友病和黏多糖贮积症。

Dow Agrosciences的ZFN技术一部分是由Sangamo授权许可的,不过Dow的技术主要应用于植物细胞的基因编辑。我们发现,Dow在中国递交的两个相关专利申请也已经获得授权。

我们在下表中总结了涉及ZFN技术的代表性专利及专利申请。

围绕ZFN的部分专利申请.

TALEN

针对TALEN,主要的玩家仍然是Cellectis和Sangamo BioSciences

熟悉CAR-T技术的同学们对Cellectis这个名字一定不陌生,这家来自法国的生物技术公司目前主要致力于开发基于CAR-T的癌症免疫疗法。

然而,Cellectis最初是依靠归巢核酸内切酶技术起家的,但随着新一代基因编辑技术(例如CRISPR技术)的发展,使得公司陷入了困境。近年来,Cellectis将基因编辑方面的研发重点转向了TALEN技术,并利用TALEN进行基因编辑而开发通用型CAR-T(UCARTs)。之所以称作通用型CAR-T,是因为Cellectis使用TALEN技术敲除了健康T细胞中表达T细胞受体的基因,从而降低异体排斥的风险,因此对于不同的患者具有普适性,而不需要采用自体T细胞进行改造。目前Cellectis有两个候选药物UCART19和UCART123都已进入临床Ⅰ期阶段,这也是全球首个进入临床试验的通用型CAR-T品种。Cellectis针对利用TALEN对T细胞进行工程化的方法在中国递交了专利申请,目前仍在审查阶段。此外,Cellectis在美国申请了保护TALEN单体和诱导双链断裂方法的专利并获得了授权。

除了Cellectis之外,Sangamo BioSciences也致力于采用TALEN技术对细胞进行基因修饰,并在多个国家递交了专利申请

我们在下表中总结了涉及TALEN技术的代表性专利及专利申请。

围绕TALEN的部分专利申请.

CRISPR

CRISPR-Cas的出现可以说具有划时代的意义,在它出现之前,基因编辑从未如此容易。CRISPR-Cas技术的主要先驱包括瑞典于默奥大学的Emmanuelle Charpentier、加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna、Broad研究所(The Broad Institute)的张锋和哈佛医学院的George Church等,他们都分别参与了成立相关公司以开展CRISPR-Cas的商业化应用,并且彼此之间竞争相当激烈

Caribou Biosciences致力于开发CRISPR-Cas技术平台在疾病治疗、农业技术、生物研究和工业技术等方面的应用,加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna是其联合创始人之一。目前,Caribou与Intellia Therapeutics合作利用CRISPR-Cas9平台开发疾病治疗的药物。Caribou针对其CRISPR-Cas9系统和能够提高CRISPR-Cas9系统靶向性的核糖核蛋白复合物递交了专利申请。

加州大学和维也纳大学(发明人包括Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier)针对DNA修饰的基因编辑系统联合申请的专利已经在欧洲获得了授权(EP2800811B1,2017年5月10日刚获得授权),而同族的中国专利申请CN201380038920.6于2017年5月4日刚拿到授权通知书,这两个专利覆盖了CRISPR-Cas系统在真核细胞如人类细胞和哺乳细胞中的应用,其同族的美国专利申请US2014068797A1正是与张锋团队的专利权争夺战中的主角。加州大学和维也纳大学将这些专利的权益独家许可给了Caribou,而Intellia又通过Caribou的独家许可获得了这些专利的相关权益。

Broad研究所针对CRISPR-Cas系统在不同国家分别递交了专利申请,部分专利也已获得授权。在已获授权的专利中,比较有代表性的包括US8871445B2(其对应的申请在欧洲也已授权,参见EP2825654B1),该专利保护的主题包括用于基因编辑的CRISPR-Cas系统、组合物及方法,涵盖CRISPR在所有真核细胞(包括人类细胞)中的应用,而同族的中国专利申请还在审查过程中。另外,Broad研究所还有一件在中国递交的保护基因编辑CRISPR-Cas系统和方法的专利申请(CN106170549A),也处于审查过程中。

先前,加州大学伯克利分校的Doudna团队和Broad研究所的张锋团队就谁首先发明了CRISPR技术在美国进行了激烈交锋,其中涉及到Doudna团队的一件专利申请(US2014068797A1)和张锋团队的12件专利申请。2017年2月,PTAB判定Broad研究所的张锋团队将继续拥有CRISPR-Cas9的相关专利(申请)权。换句话说,PTAB认为,Doudna团队的专利申请与张锋团队的专利申请涉及不同的发明,各自都可以继续就自己的发明享有权利。

哈佛医学院的George Church与张锋合作并创立了Editas Medicine公司,主要致力于用CRISPR-Cas治疗多种疾病,目前Editas Medicine正与Juno合作开发CAR-T免疫疗法,还计划于2017年开展利用CRISPR-Cas技术在体内治疗Leber氏先天性黑朦病(Leber’s congenital amaurosis)的临床试验。George Church团队(申请人为哈佛大学)对于用CRISPR-Cas调节靶核酸表达的方法在美国申请了专利并获得了授权,而且近期又递交了一系列PCT专利申请。

中国大陆的科学家也将CRISPR-Cas方法应用到了真核细胞的基因编辑中并递交了专利申请。此外,2016年底,四川大学华西医院的一个研究团队首次将利用CRISPR–Cas9进行基因编辑后的免疫细胞用于开展临床试验

我们尝试在下表中总结了涉及CRISPR技术的代表性专利及专利申请。

围绕CRISPR的部分专利申请.

在基因编辑的世界里,不同的方法虽然各具特色,但归根结底都是为了更好地实现其应用价值。然而,目前在基因编辑技术的应用中还存在不少亟待解决的问题,比如,在人类疾病治疗方面需要提高基因编辑的效率和特异性以及实现基因编辑系统的有效递送等。相信随着技术的不断成熟,基因编辑技术会更好地服务于人类社会。

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