快速读懂基因序列的技巧

2017-08-07 11:02:01岩之澜

导读

基因编辑小鼠的构建中，为了高效率成功构建动物模型，首先我们必须读懂目的基因的基本信息，如基因命名及功能，基因序列的组成，已有动物模型的研究（基因敲除是否胚胎致死？）这些都是关乎整个实验命脉。那么，今天就教大家一招，如何快速搞定基因的这些事。

查找一个基因序列和信息，有很多网站，小编觉得最常用又好用的当属NCBI和Ensembl了，下面就一起看看如何运用吧。

第一步：NCBI网站，查找你的目的基因，明确基本信息

打开NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。如下图在网站上选择Gene项，输入基因名后搜索即可找到基因。

我们以常见的抑癌基因p53为例：NCBI选择Gene项后，搜索P53

搜索结果如下图所示：会存在多种种属，包括人类Homo sapiens(human)，小鼠Mus musculus (housemouse)，大鼠Rattus norvegicus (Norwayrat)等。

基因敲除小鼠一般指敲除鼠源基因，所以我们点开小鼠的Trp53的基因序列。（注意人源该基因命名为TP53或P53，鼠源该基因命名为：Trp53，p53等）。以下用p53指代。

如下图为小鼠来源的p53基因的具体信息：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/22059

其中包含基本基因信息：GeneID，基因名称，基因功能及MGI，Ensembl链接等。

第二步： Ensembl链接，了解基因序列信息（基因转录本、以及特定转录本的外显子信息），进而才可以靶向设计sgRNA。

如下图所示：如下图所示p53基因的Ensembl信息：

1. 可以看到，P53基因共有6个已知转录本，但其中2个不翻译蛋白。

2. 基因编辑设计时，一般会选择最长的转录本。在网页的最左侧有一目录，包括基因序列的外显子，cDNA及蛋白信息等，选择特定转录本，点击左侧“exons”信息即可得到基因外显子与内含子信息，敲除基因的外显子是最主要的敲除方式。

如下图为p53基因某转录本的外显子信息：

第三步： MGI链接，明确基因及序列后，查找这个基因已有哪些研究？

MGI网站收集了大部分小鼠基因编辑的模型，可以查询特定基因的已建模型，可看到该基因对小鼠的影响，特别是基因敲除是否会胚胎致死（致死基因在胚胎时期或幼体阶段发生作用，从而不能形成活的幼体或个体早夭的现象。）

如下图所示p53基因的MGI信息：

“Nullhomozygotes show high, early-onset tumor incidence.”即已有模型验证p53纯合子基因敲除鼠会出现肿瘤高发病率，但不会胚胎致死。

以另一基因Kras为例：如下图所示Kras基因的MGI信息：

“Mice homozygous for a null allele exhibit embryoniclethality.”即已有模型验证Kras纯合子基因敲除鼠会在胚胎致死。此时就必须构建CKO小鼠。

注：在胚胎是否致死查询上，若没有明确答案或者不太确定时，要查看相关文献，进一步确认。

第四步：明确目的基因序列后，设计sgRNA

如基因敲除（knockout,KO）sgRNA的设计

根据实验目的查找目的基因序列，并确定需要编辑的具体区域。KO一般会在可编码的exon1附近设计两个间隔约100bp的靶点；
将该区域的碱基序列复制至sgRNA预测网站gRNA designer，从而预测潜在sgRNA序列。选择高分值的sgRNA靶点；
sgRNA格式: 5′-NN-N18-NGG-3′；

注意：

如果exon1太短或GC含量高时，可往后面的exon上设计。
有不同的转录本时，针对共有的exon设计；如果没有相同的exon，考虑全敲。
预测脱靶：http://crispr.mit.edu/，挑选得分较高的靶点(>80)。

具体操作步骤如下图：

以上就是我们通过NCBI及相关网站了解的信息，掌握了这些信息，差不多就可以构建基因编辑小鼠。而如果发现某一基因具有致死性，一般会考虑使用条件性基因敲除（CKO）或ES细胞打靶的方法来构建。

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