CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤耐药研究中的应用进展

2017-05-22 20:23:24国际药学研究

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统是存在于细菌和古生细菌中的一种抵御外源DNA入侵的适应性免疫反应系统。与传统的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9操作更加简便、高效。目前，该技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用，包括乳腺癌和白血病耐药等诸多方面。CRISPR/Cas9技术的应用虽仍存在脱靶效应等问题，但其应用前景非常广阔。本文就其在肿瘤耐药研究方面的应用进行综述。

肿瘤具有多基因型的特征，且基因变异驱使肿瘤的恶性发展和化疗耐药，纠正或删除这些变异基因是未来肿瘤治疗发展的一个方向。成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9,CRISPR/Cas9)是近几年发现的基因编辑技术，由于其高效性和精确性已被广泛应用于肿瘤治疗研究，利用这一技术鉴别并删除肿瘤耐药基因可有效地防止肿瘤细胞对药物的耐受[1]。它来自于细菌和古细菌中的免疫防御系统。为防御病毒或噬菌体的入侵，细菌针对特异性DNA序列并将其作为记忆，在后来的入侵中特异性序列被酶识别和降解，重新设计这个天然的免疫防御系统能达到理想的基因编辑效果[2]。目前CRISPR/Cas9系统已在哺乳动物细胞中得到成功的应用，大大加速了基因工程的发展。通过稳定或不稳定地导入CRISPR成分，Cas9能成功介导单个或多个内源性位点的稳定修饰[3]。有研究团队已报道，通过不稳转染质粒编码的Cas9和单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)或Cas9-sgRNA核糖蛋白复合物(RNP)成功编辑了内源基因；利用Cas9核酸酶和dead Cas9(dCas9)效应器进行高通量CRISPR筛选以鉴别、分类与不同生物表型有关的基因；利用CRISPR/Cas9技术精确敲除小鼠体内基因，能快速产生小鼠遗传模型[4]。此外，CRISPR/Cas9比传统的蛋白引导的编辑工具锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(transcription-activator-like effector nucleases,TALEN)更有优势：①ZFN或TALEN工具需要重新合成大量的引导蛋白，而CRISPR/Cas9靶向新的位点仅需要一个互补sgRNA，相对更加简单；②CRISPR/Cas9系统中，多个sgRNA可靶向不同的基因位点，使Cas9能同时平行编辑不同的基因[5-6]。这些优点使CRISPR/Cas9技术深受研究者的青睐，并被广泛应用。

CRISPR/CAS9具有高效的基因靶向作用，通过设计特异性sgRNA定点靶向耐药基因或致癌基因并将其删除或修饰，可快速、有效地逆转肿瘤耐药，这一技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用。

1　CRISPR/Cas9基因编辑技术

1　CRISPR/Cas9系统结构

CRISPR/Cas9系统组成简单(图1)，其基因座从5′端到3′端为反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA)，一系列CRISPR相关基因即Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1和Cas2，后者是获得新间隔序列必需的基因，靠近3′端是CRISPR基因座，此基因座由长度相似的间隔序列(spacers)与一系列高度保守的正向重复序列(repeats)间隔排列组成；另外在CRISPR位点，第1重复序列上游有一段前导序列，可作为启动子启动CRISPR基因序列的转录。

图1　CRISPR/Cas9系统结构示意图

1. 2　CRISPR/Cas9系统作用机制

CRISPR/Cas9系统通过序列特异性地靶向外源DNA或RNA防御外来基因的入侵，特别是病毒和质粒。一个CRISPR/Cas9基因位点包括1个CRISPR相关基因序列即Cas9基因和1个CRISPR序列基因，后者为一系列被间隔序列间隔开的重复序列，间隔序列是适应免疫的关键因素，因为它们储存第一次不成功的外源基因入侵的“记忆”，这个“记忆”能识别并使第二次的入侵瓦解[7]。

CRISPR/Cas9介导的免疫过程包括3个步骤：适应、表达和干扰（图2）。

图2　CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑原理示意图

①适应阶段：Cas9蛋白复合物靶向入侵的外源DNA片段原间隔序列(protospacer)并将其裂解，原间隔序列经加工后，作为新的间隔序列整合入宿主CRISPR序列的5′端；②表达阶段：CRISPR序列发生转录，整合入CRISPR序列的原间隔序列被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，随后被加工成成熟的CRISPR RNA(crRNA)，crRNA与tracrRNA形成双链二级结构-R环，Cas9蛋白聚集在其周围，三者组合成CRISPR核糖核蛋白复合体；③干扰阶段：当同源病毒或质粒入侵时，在Cas9核酸酶的作用下，CRISPR核糖核蛋白复合体识别原间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif, PAM)并对与crRNA互补的外源双链DNA(dsDNA)进行剪切。

1. 3　基因切割位点的选择

通过共表达特异性sgRNA和核酸内切酶Cas9，CRISPR/Cas9能靶向剪切任何＜20个核苷酸的DNA序列，要实现精确的剪切，需要满足2个条件：①靶点序列与基因组中的其他序列相比是独特的；②靶点需位于PAM的上游，结合靶点需要PAM序列，精确靶向序列依赖于Cas9的特异性。Cas9蛋白通过其表面的活性结构与sgRNA(crRNA与tracrRNA复合物)的支架结构域结合成核糖蛋白复合物，与sgRNA结合后Cas9的构象改变，将无活性的、非DNA结合构象分子转变成有活性的DNA结合构象分子，Cas9-sgRNA复合物的切割位点将与PAM上游基因序列结合，但只有与间隔序列配对的基因才能被Cas9切割。Cas9核酸酶有两个功能内切酶结构域：类RuvC结构域和HNH核酸酶结构域。HNH可对与间隔序列互补的DNA单链进行切割，其切割位点在PAM上游3个核苷酸(nt)处，而类RuvC结构域对另一条链进行切割，其切割位点在PAM上游3～8 nt处，结合靶点后，Cas9进行第2次构象改变，将核酸酶定位到切割位点对DNA链进行切割。Cas9介导的DNA切割的结果是双链断裂(double strand break, DSB)，靶点DNA在PAM序列上游3～4 nt处。

2　CRISPR/Cas9技术在耐药研究中的应用

CRISPR/Cas9技术操作简单且能精确地剪切基因，因此已广泛应用于基因工程，它在肿瘤生物学中的应用主要在以下几个方面：①快速建立遗传模型，CRISPR/Cas9系统能对内源位点快速靶向修饰，为建立遗传模型提供了更加简便的方法，除了简化原癌基因和肿瘤抑制基因的研究，还能快速鉴别驱动和携带突变(drive and passenger mutation)；②快速建立小鼠模型，CRISPR介导的基因编辑系统能够快速产生大量具有基因组成或结构变异，或染色体重排的脴胎干细胞系，这些细胞系能用于建立具有多种变异表型的肿瘤遗传工程小鼠模型(genetically engineered mouse models,GEMM)和非种系遗传工程小鼠模型(non-germline GEMM,nGEMM)；③体细胞基因组工程，CRISPR/Cas9系统能在体内和体外对体细胞基因组进行编辑[8-10]。此外，目前其在研究肿瘤耐药方面也得到了广泛的应用。

2. 1　在乳腺癌耐药研究中的应用

根据不同的乳腺癌亚型，患者可使用化疗或靶向治疗方法，但原发性耐药或获得性耐药是不可避免的。肿瘤细胞对药物产生耐药，发生上皮-间充质转移(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)，迁移到远隔器官，导致患者死亡[11]。乳腺癌靶向药物曲妥珠单抗的治疗靶点是HER2基因，在乳腺癌患者中HER2基因过表达占15%～20%。Wang等[12]利用CRISPR/Cas9技术靶向HER2过表达乳腺癌细胞中的HER2基因，有效抑制了细胞增殖和致瘤性，而且还证明了在ADP多聚酶聚(ADP-核糖)聚合酶〔poly (ADP-ribose) polymerase,PARP〕抑制剂处理后，CRISPR/Cas9的靶向效果更加明显，这一研究为抗乳腺癌治疗提供了一个新的机制。

SHCSH2结合蛋白1(SHCSH2-binding protein 1,SHCBP1)是SRC的同系物，是胶原蛋白SHC家族的成员之一，最近报道称SHCBP1基因在乳腺癌细胞中也存在过表达现象。Wen等[13]证明了SHCBP1过表达使乳腺癌细胞增殖能力上调，增强了乳腺癌细胞的耐药性，他们利用CRISPR/Cas9技术敲除SHCBP1后观察到细胞增殖明显受到抑制，说明SHCBP1在肿瘤发展中起着重要的作用，能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。

BRM和BRG1 ATP酶是高度保守的同系物，催化染色质对多亚基人SWI/SNF染色质重塑酶的功能进行重塑。Wu等[14]证明了BRM和BRG1在乳腺癌耐药细胞中过表达，他们利用CRISPR/Cas9技术敲除MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的BRM和BRG1。结果表明，这两个基因中敲除任何一个都能减少体内肿瘤的形成，并在体外抑制肿瘤的生长。这一结果暗示BRM和BRG1可能成为肿瘤治疗的新靶点，促进逆转耐药的研究进展。

抑制雌激素受体(estrogen receptor,ER)α活性的药物能有效抑制乳腺癌发展，然而，耐药性的产生是现在临床治疗的主要问题。最近研究显示，在治疗过程中，ER基因的变异率＞20%，而且这些变异大多数只是几个氨基酸的突变。Harrod等[15]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使MCF7细胞中单个氨基酸残基-酪氨酸537突变，产生酪氨酸537变异的细胞系Y537S，利用RNA序列分析技术和ER芯片序列分析基因组变化。结果显示，Y537S突变增强了ER基因活性，促进细胞生长，变异的MCF7细胞对抗雌激素的药物他莫昔芬和氟维司群产生耐药。这些研究说明了ER突变在内分泌化疗耐药中的重要性，并证明了利用敲除变异模型研究新的治疗方法的重要性。

2. 2　在白血病耐药研究中的应用

白血病是一种常见的血液恶性肿瘤，主要以联合治疗为主，但多药耐药(mutidrug resistance,MDR)依然是化疗失败的主要原因[16]。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKI)能用于治疗慢性粒细胞性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)，但是白血病起始细胞(leukemia initial cell, LIC)对TKI耐药。Xie等[17]证明了多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2)的亚单位EZH2在CML的LIC中过表达，EZH2对于CML细胞系形成和存活是必需的。他们用CRISPR/Cas9技术敲除CML模型小鼠里的EZH2基因，抑制了LIC细胞起始和发展，在敲除了EZH2的CML LIC中EZH2的同系物EZH1的表达也有所减少，PRC2的表达受到完全抑制。这一研究为CML治疗中TKI的耐药机制提供了理论基础，提示EZH2抑制剂可能成为治疗CML的新途径。

蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)是治疗多发性骨髓瘤(mutiple myeloma, MM)的有效化疗药物，然而耐药性的发展限制了其长期疗效，最近有研究靶向20S蛋白酶体上游的泛素化受体，旨在降低其治疗毒性。Song等[18]证明了蛋白酶体相关泛素化受体Rpn13在MM细胞中的表达比在正常血细胞中的表达多，Rpn13-siRNA降低了MM细胞的存活率，RA190是一种新型抑制剂，靶向Rpn13，抑制蛋白酶体作用，但是并不抑制蛋白酶体活性。CRISPR/Cas9敲除Rpn13的结果证明RA190的抑制作用依赖于Rpn13，RA190降低了MM细胞的存活率，抑制MM细胞在骨髓间充质增殖，克服了MM细胞对硼替佐米的耐药性，说明靶向Rpn13可为临床评估克服蛋白酶体抑制剂的耐药提供理论基础。

染色体7和7q的反复性删除(recurring deletions)经常发生在急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)中，与耐药相关，然而，7q的功能相关性肿瘤抑制作用尚不清楚。Chen等[19]用RNA干扰(RNAi)和CRISPR/Cas9技术删除7q36.1染色体上的MLL3基因，促使AML发生。结果显示，抑制MLL3基因阻滞了造血干细胞和前体细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPC)的分化，MLL3敲除的白血病细胞对传统化疗耐受，但对BET抑制剂JQ1敏感，这一研究为治疗白血病提供了一个新的思路。

CML中肿瘤抑癌基因ASXL1经常发生变异，引起耐药。Valletta 等[20]利用CRISPR/Cas9技术纠正CML细胞系KBM5(缺少ASXL1蛋白表达)中的ASXL1变异，使ASXL1蛋白重新表达，减缓了细胞生长，而且KBM5细胞重新表达ASXL1的细胞骨髓分化能力增强，这一研究为在白血病细胞中通过该技术纠正驱动基因变异提供了证据。

2. 3　在黑素瘤耐药研究中的应用

黑素瘤是致死性最强的一种皮肤癌，联合治疗在用药早期可达到很好的效果，但随着黑素瘤细胞转移扩散，极容易产生耐药，研究者采用靶向治疗手段有效抑制了黑素瘤的发展[21]。在50%黑素瘤中已鉴别出BRAF基因变异，频繁的BRAF基因变异促进了BRAF抑制剂的发展，然而BRAF抑制剂的获得性耐药限制了其抑制黑素瘤的疗效，而棉酚能保持长期的黑素瘤抑制效应。Kim等[22]为了深入研究在棉酚的作用下A375P黑素瘤细胞中细胞自噬的作用，利用CRISPR/Cas9系统敲除了BRAF变异的A375P细胞中的自噬蛋白5(autophagy protein 5,ATG5)，发现与ATG5敲除的A375P细胞相比，棉酚能更有效地抑制野生型A375P细胞生长，而且ATG5敲除的A375P细胞在棉酚作用后依然能自噬，说明棉酚能介导ATG5依赖性自噬作用。

MCL-1属于BCL-2抗凋亡蛋白家族，与黑素瘤耐药相关。Mukherjee等[23]证实了MCL-1抑制剂SC-2001能有效杀灭非起始黑素瘤细胞，但即使以很高的剂量也不能有效清除黑素瘤起始细胞(melanoma initial cells, MIC)，而且SC-2001和ABT-737(BCL-2/BCL-XL/BCL-W抑制剂)联合作用能有效抑制MIC自我更新。他们利用CRISPR/Cas9技术下调促凋亡蛋白NOXA和BIM，证实了这两个蛋白联合作用引起细胞凋亡。

CRL4(cullin-ring ligase 4)-CDT2泛素连接酶是最近发现的一种细胞增殖调控剂，CRL4-CDT2通过在细胞周期S期靶向降解CDT1，SET8和P21阻止DNA复制的进行。Benamar等[24]研究显示CDT2在黑素瘤细胞中过表达，预测其与耐药的发展有关。他们证实了MLN4924(一种NEDD8活化酶特异性抑制剂)在体外能有效抑制黑素瘤细胞增殖，利用CRISPR/Cas9技术敲除黑素瘤细胞中的CDKN1A(编码p21)或SET8基因，证明了通过p21或SET8降解能介导MLN4924的抑制DNA复制作用。这一发现表明在黑素瘤中CRL4-CDT2-SET8/p21降解复合物是MLN4924的主要靶点，有利于研究临床患者对MLN4924的耐药。

2. 4　在肺癌耐药研究中的应用

肺癌是发病率和病死率很高的恶性肿瘤，其治疗方法主要有手术、放疗、化疗和靶向治疗，其中化疗是主要的治疗手段，但是肺癌对化疗药物很易产生耐药，因此急需研究新的方法克服肺癌耐药[25]。Mdm2癌基因能使p53肿瘤抑制基因失活，因此阻断p53与Mdm2之间的相互作用，成为肿瘤治疗的方法之一，但p53重新激活仍会引起耐药，其再激活机制尚不清楚。Wanzel等[26]利用CRISPR/Cas9靶向技术验证得出肺癌中nutlin的活性严格依赖于p53的功能，nutlin阻碍p53与Mdm2结合，抗肿瘤药RITA能结合已与Mdm2作用的p53的N端，引起DNA损伤，对RITA有原发性或获得性耐药的细胞对顺铂(DNA交联复合物)发生交叉耐药，增强DNA修复，使p53再激活的药物作用被特异性的耐药机制限制，这一耐药机制能通过CRISPR/Cas9鉴别并应用于临床治疗中。

瘤内基因异质性是肿瘤发展过程中的基本特性，Guernet等[27]采用CRISPR/Cas9技术设计了不同的sgRNA，后者能与不同的变异基因配对，以追踪发生变异的肿瘤细胞亚型。他们利用这一方法建立肺癌细胞对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂耐药的模型，以评估联合用药的治疗效果，说明CRISPR/Cas9技术可对特异性变异基因进行追踪，并简化复杂肿瘤模型的建立过程。

有3%肺癌的MET连接位点变异导致外显子14缺失，有报道称带有MET连接位点突变的肺癌患者对MET抑制剂有反应。Togashi等[28]利用CRISPR/Cas9系统建立了MET外显子敲除的HEK293细胞系。结果显示，敲除了MET外显子14的HEK293细胞系中MET蛋白的表达水平更高，在此细胞中MET磷酸化水平升高，活性增强，而细胞对MET抑制剂的敏感性增强，这一发现促进了对携带MET外显子14缺失的肺癌进行MET靶向治疗研究。

2. 5　在其他肿瘤耐药研究中的应用

除上述肿瘤外，CRISPR/Cas9在其他类型肿瘤耐药的研究中也有广泛应用。

前列腺癌研究中，NANOG基因的表达能抵抗雄激素缺乏，但是并无确切的研究说明NANOG基因能促进肿瘤的恶性转移。Kawamura等[29]利用CRISPR/Cas9技术敲除DU145前列腺癌细胞中的NANOG，与野生型DU145细胞相比，敲除了NANOG的细胞能缓解肿瘤恶性发展和肿瘤细胞对药物的耐药。

膀胱癌研究中，Yang等[30]利用CRISPR/Cas9技术将膀胱癌干细胞ARID1A、GPRC5A 和MLL2基因协同突变，发现基因变异后细胞的自我更新和肿瘤起始能力显著增强。这一研究说明通过精准的分析技术可证明人膀胱癌干细胞的生物起源。

顺铂耐药的发展往往伴随着药物吸收减少，外排增加，以前有报道在酵母和整点类胚胎成纤维细胞中Cu转运蛋白和蛋白陪伴分子参与顺铂的吸收、外排和细胞内分布。Bompiani等[31]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人HEK-293T和卵巢癌细胞OVCAR8细胞中的Cu转运蛋白CTR1，CTR2和Cu转运蛋白陪伴分子ATOX1和CCS。结果显示，与亲代细胞相比，敲除细胞明显生长缓慢，而且敲除不同的基因靶点，细胞对Cu表现的敏感性不同，但与亲代细胞对顺铂的敏感性相比，敲除细胞对顺铂的敏感性并无很大变化，说明CTR1、CTR2、ATOX1或CCS并无促进顺铂进入细胞和细胞核的机制。

胰腺癌对很多临床治疗药物耐药，Mazur等[32]研究发现，BET蛋白家族抑制剂JQ1通过抑制MYC活性和炎症信号分子抑制小鼠胰管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)的发展。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂SAHA联合JQ1促进细胞死亡，抑制恶性PDAC的发展，他们用CRISPR/Cas9技术对PDAC小鼠体内基因进行编辑，发现恢复p57活性并同时抑制BET和HDAC能有效促进PDAC细胞死亡。这些研究为治疗人恶性PDAC提供了新思路。

此外，核苷酸转运蛋白hENT1和hCNT3的低表达使细胞对吉西他滨的吸收减少，与PDAC对吉西他滨耐药有关。Hesler等[33]研究发现，利用CRISPR/Cas9技术敲除半胱氨酸富集的血管生成因子61(cysteine-rich angiogenic inducer 61, CYR61)使hENT1和hCNT3的表达增加，细胞对吉西他滨的吸收增多，并且PDAC细胞对吉西他滨的敏感性增强，说明通过靶向CYR61可缓解PDAC对吉西他滨的耐药。

Peng等[34]发现在成胶质细胞瘤细胞中经常发生染色质组装因子1亚基A(chromatin assembly factor 1 subunit A, CHAF1A)上调，且与成胶质细胞瘤治疗预后不良有关，CRISPR/Cas9技术敲除CHAF1A后促进成胶质细胞瘤细胞U251和U87凋亡。这一发现提示可将CHAF1A作为新的治疗靶点改善成胶质细胞瘤预后不良。

3　CRISPR/Cas9技术应用存在的问题与解决策略

CRISPR/Cas9基因编辑技术虽快速简便，但与ZFN和TALEN基因定点编辑技术一样，也存在脱靶效应(off-target effects)，主要表现为对基因组中非特异性位点进行切割，导致与靶点序列相似的序列发生变异。有研究报道[35]，在人组织中Cas9能引起靶点以上5 nt的脱靶位点发生变异，在某些位点上，脱靶位点发生变异的效率比靶点更高。在应用CRISPR/Cas9技术的过程中首先要考虑脱靶问题，因为错配引起的脱靶切割使不需要的变异增加，且引起染色体重排，这可能会激活原癌基因或阻碍肿瘤抑制基因的作用，从而引起肿瘤恶性发展[36-37]。

Cas9和sgRNA都能引起脱靶变异，目前解决脱靶效应的策略主要有以下几个方面。

3. 1　精确设计sgRNA

通常一个sgRNA有3个错配即可引起脱靶，为了设计sgRNA，脱靶位点应存在一个限制序列，限制sgRNA与脱靶位点结合，并且PAM应缺失5′-NGG或5′-NAG，而PAM近端核苷酸的错配影响sgRNA靶向DNA的效应，因此，PAM近端核苷酸是Cas9结合靶点的决定因素。序列测定后染色质免疫沉淀说明在PAM近端结构域仅10个碱基对就能充分调控Cas9结合，另外sgRNA的GC含量也能影响脱靶效应，高GC含量能促进sgRNA与靶点的结合，不易产生脱靶变异。

3. 2　选择合适的Cas9

含有RuvC和HNH结构域的野生型Cas9在靶点切割dsDNA，容易切割到其他与靶点相似的基因序列，引起不需要的脱靶变异。

在变异Cas9（Cas9n）中，HNH中的H840A或RuvC中的D10A发生变异，Cas9n能在靶点产生一个切口而不是DSB，这个切口被高保真性碱基切除修复途径修复，并因此增加CRISPR/Cas9系统的特异性，Cas9n能在不影响靶点效应的情况下，使脱靶效应减少到1/50～1/1000。

dCas9同时含有HNH结构中H840A变异和RuvC结构中D10A变异，无切割能力但保留了DNA结合能力，因此能被用于控制基因表达，其沉默基因的效应比一般RNAi更强。研究显示，结合Fokl核酸酶结构域的dCas9能在不引起DNA损伤的情况下特异性地编辑基因，其中dCas9结合靶点，Fokl核酸酶引起DSB，从而提高靶点特异性，有效减少脱靶效应[36,38]。

4　结语

CRISPR/Cas9技术能高效地编辑基因，其在肿瘤耐药研究中的应用正在获得广泛的关注，相信随着该技术的快速发展，研究者可以通过其迅速鉴别与筛选不同肿瘤类型的耐药相关基因，为肿瘤耐药的机制研究和克服耐药的治疗提供新的思路和理论依据。作为治疗策略，CRISPR/Cas9技术靶向患者体内癌基因尚未成熟，但这种基因治疗方式的前景依然值得期待。近来有研究证明这一技术能在具有遗传疾病的小鼠肝中永久地校正基因变异，因此，未来可利用非病毒介质将CRISPR/Cas9导入体内以进行有效的基因编辑，允许校正单个或多个驱动变异。除了永久校正肿瘤相关变异，它也能体外编辑免疫细胞应用于免疫治疗，如用于研发CAR-T细胞[39]。Jinek和Chylinski[40]研究团队证明了CRISPR/Cas9系统编辑RNA的潜力。CRISPR/Cas9为基因工程领域带来了一场科学革命，这场革命能改变基础生物学和生物医学的所有层面，为克服肿瘤耐药提供了更多的可能。