解码生命 守护健康

编辑“生命天书”的魔剪

文/陈咨余

CRISPR/Cas技术

从孟德尔的豌豆实验催生了遗传学的两大定律，到摩尔根的果蝇杂交实验揭示了基因是组成染色体的遗传单位，再到沃森和克里克发现DNA的双螺旋结构,近200年来，人类不仅逐渐认识到遗传因子“基因”的存在以及其控制生物性状的作用，更在努力解答腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的排列组合是如何决定人与人、人与其他物种之间的不同。三个基本的问题萦绕在每个生物学家的脑海里：每个基因是做什么的?我们如何找到致病的基因突变?我们该如何处理这些突变的基因？

1990年至2003年，美、英、法、德、日、中六国科学家共同实施了“人类基因组计划”，推动了基因测序技术发展。这是基因革命的第一个浪潮，人类自此掌握了阅读“生命天书”的能力。而让人们真正拥有了编写“生命天书”的能力的是基因革命的第二个浪潮——“基因组编辑”。

所谓基因编辑技术，是指对DNA核苷酸序列进行删除和插入等操作。换句话说，基因编辑技术使得我们可以依靠自己的意愿改写DNA，从而改变生物性状。早在20世纪90年代，第一代基因编辑技术就出现了。然而，利用TALENs （转录激活样效应核酸酶）与ZFN（锌指结构域核酸酶）这两种基因编辑技术做基因敲除，不仅在技术上难操作，在经济、时间、精力的花费都非常大。高门槛、低准确性等缺点一直困扰着研究基因工程的学者。因此，能够方便而精确地对DNA和核苷酸序列进行编辑，是科研工作者们长期以来的梦想。

伴随着CRISPR/Cas技术的诞生和成熟，基因的修剪改造变得“平民化”。成本低、易上手、效率高等优势让这项技术有了一个新的名字“编辑生命天书的一把魔剪”。这项不仅如风暴般席卷全球，在科研领域掀起巨大波澜，而且被誉为“本世纪最具创新力的创新技术”具体是怎么运作的呢？

CRISPR/Cas 系统由两大部分组成：CRISPR序列和Cas基因。CRISPR序列全称“成簇的规律间隔的短回文重复序列”。这个序列由众多短而保守的重复序列区和间隔区组成。在这段序列的上游有一个多态性的家族基因，由该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated），简称Cas。 CRISPR/Cas系统在被广泛运用在基因编辑中以前其实是普通细菌识别并降解来自噬菌体的DNA，从而阻止噬菌体的感染和复制，防御噬菌体入侵的一种机制。同时，它也为细菌提供了获得性免疫，来抵抗噬菌体或者外源质粒的再次入侵。

当噬菌体首次入侵宿主细菌时，它的DNA双链被注入细胞内部。每一条入侵者的DNA上都有一段原间隔序列，并且在它的旁边有一段特定序列（原间隔序列临近基序PAM ）像名字一样能够轻而易举地识别这段原间隔序列。这个识别任务由细菌DNA中CRISPR序列上游的Cas序列转录出的Cas蛋白进行。Cas蛋白在其他酶的协助下能够把这段原间隔序列剪切下来，并插入细菌DNA中临近CRISPR序列前导区的下游。细菌DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。不同的入侵者存在不同的原间隔序列，这样一来细菌DNA的CRISPR序列中就会存在不同的间隔序列。

那当噬菌体DNA再一次入侵细菌的时候又会发生什么呢？在第一次入侵的时候，各个入侵者的基本信息（间隔序列）都已经被记录在了细菌的黑名单（CRISPR序列）中。当任意一个入侵者再次到来时，CRISPR序列会在“指挥官”（前导区）的调控下转录出大型RNA分子 (pre-crRNA)，CRISPR序列中的重复序列区会转录出发卡结构的RNA（tracrRNA)来活化Cas蛋白。在Cas蛋白与核糖核酸酶（RNaseIII ）的帮助下，一整串有着各个入侵者信息的pre-crRNA被剪切出一段段针对不同入侵者的crRNA。这样一来，它们能像定向导弹直接击向相对应的入侵者的DNA，并把它切断，从而干掉入侵者。

▲自然界细菌利用CRISPR/Cas系统进行免疫反应

虽然在20世纪末科学家就已经意识到了原核细菌中的CRISPR序列，但是直到21世纪初，微生物这一特殊的免疫系统才被科学家加以利用，成为生物医学史上第一种可高效、精确、程序化地修改细胞基因组，包括人类基因组的工具。

自然界中CRISPR/Cas系统极为多样，目前在DNA编辑中被广为运用的是由最简单的type II CRISPR改造而来的CRISPR/Cas 9系统。科学家将编码有核酸内切酶活性的Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。同时还加入了入核信号元件让这些组分可以进入真核细胞的细胞核。这样一来，只要科研人员针对需要编辑的DNA序列合成一段DNA序列，插入这个载体的特定部位。在转入宿主细胞后，这段基因产生的人工构建的向导RNA（gRNA）就像细菌内的tracrRNA 和crRNA 的复合体，能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。更通俗点来讲，传递基因组信息的“向导”RNA，领着切割 DNA 的“剪刀”剪接酶在茫茫的基因中搜寻，直至发现特定的核苷酸序列，然后将自己贴合上去。一旦剪接酶锁定了匹配的DNA序列，它就能剪切和粘贴核苷酸，如同word里查找替换功能一样精确。

▲CRISPR/Cas 系统的科研历史

近些年来，科学家不断利用CRISPR/Cas系统取得惊人成就。 那这项日新月异的技术在未来还有哪些振奋人心的前景呢？

从这款大飞机的命名来看，第一个字母“C”是英文“China”的首字母，也是商用飞机英文缩写COMAC的首字母，第一个“9”的寓意是天长地久，“19”代表的是中国首型大型客机最大载客量为190座。C919大型客机是建设创新型国家的标志性工程，具有完全自主知识产权，被寄予厚望。

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利用动物为人类提供器官移植源

人类移植器官的短缺一直是器官移植的瓶颈问题，医学家便把目光转向了同为哺乳动物的猪类。然而，用猪培育可供移植的器官最大的技术障碍之一在于猪体内存在一些有害基因。这些基因可能给人类带来新的疾病，并且在移植初期会攻击人体的免疫系统使之造成排斥反应。中国学者杨璐菡所在的哈佛大学的研究团队利用CRISPR/Cas 系统敲除了猪基因组中的62个病毒基因，扫清了猪器官用于人体移植的重大难关，为全世界需要器官移植的上百万病人带来希望。

▲利用CRISPR敲除猪体内致病基因使异体器官移植变为可能

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打造基因驱动系统

“基因驱动”最早由伦敦帝国理工学院进化遗传学家Austin Burt提出，是一个能够快速将特定性状扩散到群体中去的系统。2015年11月，加州大学的分子生物学家Anthony James宣布通过利用基于CRISPR/Cas9基础的基因驱动技术研制出一种携带抗疟疾基因并能将该基因近乎100%的传给后代的转基因蚊子，从根源上有效阻止疟疾的传播。这意味着，在不久的将来，我们或将能够根除疟疾、登革热等虫媒疾病，同时消灭或控制入侵物种。

▲利用CRISPR的基因驱动系统的转基因蚊子来彻底根绝疟疾

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根治疑难杂症

基因治疗是指通过操作遗传物质（无论是人类本身的或外源的）来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的错乱、杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等。利用CRISPR/Cas系统指哪打哪的特征，我们可以破坏特定基因，观察结果，以此解开基因各司何职的奥秘，找出癌症细胞的阿喀琉斯之踵。并且通过采用CRISPR技术，锁定诸如HIV、肝炎和人乳头状瘤病毒，并摧毁这些顽固的DNA病毒。虽然目前已经在体外实验上得到证实，但离实际应用还是任重道远。

基因编辑技术可能开启一个现在无法想象的全新世界，最典型也是最受质疑的就是关于创造生命或创造人类的问题。2015年底，中美英等多国科学家和伦理学家在华盛顿举行“人类基因编辑国际峰会”。会后声明划出的红线是禁止出于生殖目的而使用基因编辑技术改变人类胚胎或生殖细胞。基因剪刀技术让科学家们操纵基因的梦想得到实现，它的能力令人极其兴奋。这项“本世纪最具创新力的创新技术”，这把编辑生命天书的“魔剪”的未来如何，让我们拭目以待。