遗传性视网膜疾病基因治疗趋势与面临的挑战
庞继景 徐帆
325027温州医科大学眼视光学院（庞继景，温州医科大学特聘教授/佛罗里达大学医学院眼科；徐帆，广西壮族自治区人民医院眼科/佛罗里达大学医学院眼科）
通信作者：庞继景，Email：jpangoph@hotmail.com
【摘要】 基因诊断技术的快速发展，为基因治疗奠定了基础并拓展了广阔空间。基因替代疗法、抗新生血管基因疗法、光遗传基因疗法等多种方法的视网膜疾病基因治疗临床试验正在开展，并取得丰硕成果，逐步证实了遗传性视网膜疾病基因治疗的有效性和安全性。新兴的基因编辑技术在治疗视网膜显性遗传或基因较大不能应用腺相关病毒载体治疗的隐性遗传病的动物试验研究方面也展现了良好的前景，使大部分视网膜遗传疾病理论上都有希望用安全高效腺相关病毒载体得到治疗。了解遗传性视网膜疾病基因治疗趋势与面临的挑战，各方共同努力面对挑战，相信基因治疗很快将造福于中国遗传性视网膜疾病患者。
Progress and challenge of gene therapyon inherited retinal diseases
Abstract: The rapid development of genetic diagnosis-relatedtechnologies has paved a wide road for gene therapy. Different gene therapyclinical trials for retinal disorders, including gene-replacement therapy,anti-neovascular gene therapy and opotogenetic gene therapy, have been developedand achieved fruitful results, which have gradually confirmed the efficacy andsafety of AAV-mediated gene therapy for recessive retinal diseases. In recentyears, novel gene editing technologies also shows great potential to treat dominantdisease or recessive disease when the therapeutic gene is too big to fit adeno-associatedvirus (AAV) vectors. These results make it possible for most of the patientswith inherited retinal diseases to be treated by the safe and effectiveAAV-mediated gene therapy, which will also benefit Chinese patients soon.
基因诊断与疾病动物模型制作两方面的技术进步和成本降低，使越来越多的致病基因被发现，其功能被确认。这为遗传性疾病基因治疗奠定了基础并且促进了基因治疗研究的进展。视网膜具有解剖层次清晰且相对封闭、视网膜下腔具有免疫豁免、载体应用量较少且易于到达病变区域、操作者在直视状态下可以准确注射和观察治疗变化、疗效容易判断等优势，这使得上世纪90年代开始兴起的基因治疗研究，本世纪初终于首先在眼科遗传性视网膜疾病的研究领域获得突破[1,2]。将相关正常基因在不可逆性病理改变出现前转入由于由于基因隐性突变造成的具有功能性蛋白缺失的相应细胞，不但可以迅速恢复视功能和（或）视行为，还可以阻止相应视网膜变性的发生，达到治愈目的[1]。从2007年开始第一个视网膜色素上皮（RPE）65基因突变引起的Leber先天性黑矇（LCA）2型（LCA2）临床床试验以来，基因治疗在遗传性视网膜疾病中的应用取得了令人瞩目的进展。视网膜疾病特别是遗传性视网膜疾病基因治疗已成为基因治疗领域的热点并展现出广阔的应用前景。
1 遗传性视网膜疾病基因替代治疗
截止2016年10月，已有293种遗传性视网膜疾病的致病基因被发现，256种基因已经完成功能鉴定（https://sph.uth.edu/retnet/）。针对这些基因，目前已开展多项基因治疗临床试验。其中较为有影响的包括RPE65基因突变引起的LCA2、MERTK基因突变引起的视网膜色素变性（RP，MERTK）、REP1基因突变引起的无脉络膜症、ABCA4基因突变引起的Stargardt病、RS1基因突变引起的青少年型视网膜劈裂症（性连锁型视网膜劈裂症）、MYO7A基因突变引起的Usher综合征1B亚型、ND4基因突变引起的Leber遗传性视神经病变[3-8]等。开展最早且效果最显著的就是LCA2基因替代疗法临床试验[9,10]。临床试验确认了前期动物试验的结果：只要在隐性遗传患者相关细胞中表达出原来缺失的功能性蛋白，就可以恢复原细胞的相关生理功能；治疗时病变越轻，效果越好，疗效越持久。2015年已经获得美国食品及药物监督局孤儿药认证的补充RPE65的基因治疗方法在III期临床试验中取得了较好的治疗效果[11,12]。目前其III期临床试验已经结束，结果预定在2017年初上报美国FDA。如获批准，将会成为全球首个获批的眼科基因治疗产品。
应用腺相关病毒（AAV）介导的基因疗法治疗无脉络膜症也获得较好的长期疗效，证明应用AAV介导的基因替代疗法治疗由较小基因突变造成的隐性视网膜遗传病，特别是原发病灶在RPE细胞的遗传病具有较好效果[13,14]。这个试验的成功对于渐进式失明类疾病的治疗更具有里程碑的意义。中国学者近期也开展了针对线粒体遗传疾病Leber遗传性视神经病变的临床研究并发现治疗眼部分视功能得以恢复。表明基因治疗对于亚洲人群也具有较好的应用前景[15]。此外，CNGB3突变引起的全色盲1型和（或）CNGA3突变引起的全色盲2型基因替代疗法、渗出型老年性黄斑变性抗新生血管基因疗法、异种成视力基因转入晚期RP患者神经节细胞和（或）双极细胞的光遗传基因疗法等正在开展相关临床试验。上述研究大部分应用的是AAV载体并取得了较好的结果。AAV介导的基因替代疗法治疗由较小基因突变造成的隐性视网膜遗传病，特别是原发病灶在RPE细胞的遗传病，很可能成为将来早期基因替代疗法的首选治疗方案。
基因治疗在疾病早期效果较好，然而Cideciyan等[16]对中晚期LCA2患者视网膜下腔注射治疗3年后临床随访时发现，虽然治疗处视功能明显改善，但随时间延长，视细胞凋亡还在缓慢进行，恢复的视功能也有逐渐下降趋势。有学者认为，治疗孤岛区视细胞继续死亡除了可能与视网膜下腔注射引起的视网膜脱离以及较小治疗孤岛（占全部视网膜的20%左右）区周围变性/死亡细胞释放的有害物质渗透有关外，主要与治疗区视细胞在治疗前已开始不可逆性凋亡过程相关[12]。解决方法有两种：一是开发通过玻璃体腔注射就能转染全部或包括黄斑部的大部视网膜的新型高效AAV载体及相关技术，使全部或大部视网膜病变细胞同时得到治疗，阻止未治疗区对治疗区的侵蚀，同时解除因视网膜脱离而造成的副损伤，这对各期患者都有意义，特别是对黄斑部/锥细胞疾病患者以及早期未发病患者能否能得到彻底治愈具有重要意义；另一种是基因替代疗法联合应用抗细胞凋亡疗法阻止或延缓治疗区的细胞死亡，这可在恢复残存视细胞功能的同时，尽量延缓这些细胞的存活时间，进而使治疗眼获得的视力得到尽可能长时间的保存。这对中晚期患者更重要。
2 遗传性视网膜疾病基因编辑治疗
由于AAV只有4.7千碱基对（kb），仅能满足现有293种致病基因中不到一半的致病基因装载要求，对于较大致病基因目前只能应用容量较大的慢病毒载体或腺病毒（Adenovirus，Ad）载体。但Ad载体表达时间有限，不适合需要终生表达的遗传病；慢病毒载体除安全性外，还存在转染率低的问题，特别是对于成熟的视细胞转染效率更差。所以，现在进行的两个Stargardt病（ABCA4基因突变）和Usher综合征1B型（MYO7A基因突变）慢病毒载体相关临床试验都是和RPE病变有关，而且疗效报道也不如LCA2和无脉络膜症等应用AAV载体的临床试验出现得快。
但是，对于显性遗传病，仅转入正常基因尚不够；还需要首先将能产生毒性产物的突变基因纠正或用正常基因替代。近年来研究者正在尝试通过基因编辑技术克服上述瓶颈。这也是未来发展的一个重要方向[17,18]。基因编辑技术是对基因组进行切割编辑，并利用基因组自身的修复功能，最终实现对突变致病基因进行改造的一种有效方法[17]。目前，已经发展了锌指核酸内切酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）以及近两年刚出现就引起研究者极大兴趣的规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas内切酶9（CRISPR/Cas9）等多项基因编辑技术[19]。与ZFN和TALEN以蛋白质介导的DNA识别方式不同，CRISPR/Cas9用核苷酸介导的碱基配对方法识别DNA，极大提高了识别效率，同时降低了脱靶几率。和其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9还有设计简单且可以实现多靶点操作等优点。
针对遗传性视网膜疾病治疗途径，目前有离体基因编辑和在体基因编辑两大方向。离体基因编辑主要研究思路为在体外将自体皮肤来源的细胞去分化转变为诱导多能干细胞（iPSCs）后，利用基因编辑技术纠正突变的致病基因，再将iPSCs诱导为RPE或光感受器细胞，最终再移植回患者眼中[20]。近期有学者将其使用在性连锁遗传性RP（RPGR基因突变）患者中诱导出的iPSCs，利用CRISPR-Cas9技术首次在iPSCs中成功修复了导致光感受器退行性改变的致病基因[21]。在体基因编辑技术可避免上述繁琐诱导分化过程。有学者利用Cas9 mRNA和靶向sgRNA联合注射方法，成功修复了携带致病基因的小鼠受精卵细胞[22]。结果表明该方法可纠正突变基因，且编辑后的基因可稳定遗传。由于基因编辑技术存在不稳定性以及伦理问题，目前仍主要是用于开展基因诊断和产前咨询阶段，针对人类生殖细胞基因编辑相关研究短期内尚不具有进入临床的现实可行性[23]。
虽然目前的以CRISPR/Case9为代表的基因编辑修复系统在理论上可以纠正大部分遗传病的病因，在治疗具有较大致病基因的隐性视网膜遗传病方面也有其独到的作用。但对大多数显性遗传造成的视网膜疾病，要想获得长久的疗效，需要尽可能多地修复全视网膜病变细胞的基因突变，避免周围未治疗区释放的毒性产物侵蚀治疗区视网膜组织。这不但需要高效的基因编辑系统，还要有相应的高效载体和合适的给药方法配合。这些都需要在将来的基础研究以及临床试验中进一步完善并进行验证。
3 遗传性视网膜疾病基因治疗的未来发展
基因治疗的安全性和有效性已经得到越来越多的临床试验证实，未来基因治疗会有广阔的市场前景。目前基因编辑的先锋公司Editas已宣布了利用基因编辑技术在2017年开始进行LCA10型（CEP290基因突变）和尤赛综合征2A亚型（USH2A基因突变）这两个具有较大致病基因的隐性视网膜遗传病基因治疗临床试验的计划。若新兴的CRISPR/cas9基因编辑修复系统通过临床试验证明确实如预测那样简单安全有效，那么具有较大突变基因和显性遗传这两个目前视网膜遗传病基因治疗中的难点都将可能通过AAV介导的基因治疗得到很大程度的解决。这也是基因治疗在这两年进入商业化快速轨道的基础。
未来中国基因治疗领域的发展首先应尽快普及基因检测，确认中国视网膜遗传病患者的发病情况。先治隐性遗传病，后治显性遗传病；先治疗能用AAV载体的疾病，后治疗需要应用其他载体的疾病；先治小基因突变，后治大基因突变疾病。同时考虑病变部位，是单纯功能性和（或）静止性病变或者有视细胞器质性和（或）进展性病变，并根据动物实验结果做综合判断。最后还要根据患者视细胞存活状况和病变发展程度，确定适用传统的基因替代疗法或异种成视力基因导入的光遗传疗法。由简入繁，先易后难，应用相对成熟技术，选择已确认安全有效的方法开始对特定研究较深入的疾病进行基因治疗，争取有一个好的开端，不走弯路，逐渐深入。对患者较多的病种，采用新药开发的商业模式；对患者较少的罕见突变病种，也可以采取科学研究的方式通过临床试验解决。通过各方共同努力，相信基因治疗很快将造福于中国遗传性视网膜疾病患者。
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（收稿日期：2016-10-31）
（本文编辑：唐健）
以上文章来自中华眼底病杂志
