地中海贫血的基因治疗
地中海贫血的基因治疗
刘华颖，李春富
作者单位： 南方春富（儿童）血液病研究院，广东 东莞 523128
通讯作者:
李春富
电子信箱：chunfugzcn@163.com
【摘要】地中海贫血的基因治疗是基于基因修正的自体造血干细胞移植。目前，临床前和临床研究已经证明了慢病毒载体基因治疗的安全性和有效性，但仍有许多因素限制其临床应用，如有效的干细胞数量和质量、基因转导效率、基因表达水平和移植前预处理方案的毒性。
【关键词】地中海贫血；基因治疗；诱导多功能干细胞
地中海贫血（thalassemiam，简称地贫）是一种常染色体遗传病。β地贫（β-thalassemia）是地贫的一种，亦称库勒贫血（Cooley’anemia）。重型β地贫（β-thalassemia major，TM）患者症状会随年龄增长而日益明显，为家庭和社会带来严重经济负担和压力［1-2］。
1 基因治疗背景
目前，地贫的治疗包括：（1）常规治疗：即规律输血和充分除铁治疗。（2）药物治疗：使用药物调节a、β或γ肽链合成提升血红蛋白（hemoglobin，Hb），目前，美国食品药品局（FDA）惟一批准用于临床治疗的口服药物是羟基脲，主要通过诱导胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin，Hb F）表达缓解疾病临床症状［3］。（3）异基因造血干细胞移植（allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT），这是目前被时间证明能根治地贫的方法。然而，由于HLA全相合供者缺乏和移植后移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）等并发症，限制了allo-HSCT治疗地中海贫血的广泛应用。（4）基因治疗：是一种新兴根治地贫的方法。本文主要讨论地贫的基因治疗基础及临床研究。
地贫突变点有100多种，目前国内临床报道的有28种［4］。我国β地贫常见突变类型为CD41-42、IVS-Ⅱ-654等［5］。基因缺失和某些点突变可以导致一部分β珠蛋白肽链的合成完全被抑制，这类称为β0地贫；而少数的点突变使β链的合成部分受到抑制，仍保留部分肽链合成，这类称为β+地贫，不同的组合可能出现不同的临床症状［6］。
重型β地贫的突变基因类型有两种， 一种是β纯合子， 另一种是β0与β+地贫双重杂合子。因β珠蛋白肽链生成受到抑制，体内无法产生β珠蛋白链，由α链和β链组成的正常的Hb A合成减少或消失。虽然多余的α链蛋白能与红细胞内γ链结合形成Hb F，但出生后，γ链合成被生理性抑制（又称为Hb链合成切换），Hb链合成本应切换为β链，但由于基因缺陷β链无法合成，剩余的α链形成多聚体导致红细胞膜容易被破坏，呈现慢性溶血性贫血表现。
目前，国内外对地贫发病机制的研究主要集中在基因缺失与突变。但在临床实践中亦发现，相同基因改变患者的临床表现可有较大差异，地贫发病机制中是否有表观遗传学机制的介入，将成为一个新的研究方向，有助于弥补单从编码基因异常方面地贫发病机制的不足［7］。
2 基因治疗策略
2.1 以造血干细胞为基因载体 以造血干细胞为基因载体，即将正常的珠蛋白基因导入病变的造血干细胞，实现正常基因的表达，是基因治疗的常用策略。而其需要解决的主要问题就是基因正确导入和基因充分表达。
其中，基因治疗载体系统是关系到基因治疗成败的重要因素之一。以前使用最多的基因转移系统是病毒载体介导的基因转移系统，使用最多病毒载体包括逆病毒载体（retro virus vector， RV）和腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus， AAV）载体。RV具有宿主范围广、转染效率高，整合的外源基因可在靶细胞中永久表达等优点，但存在明显的遗传稳定性、使用安全性等方面的隐患；AAV安全性虽然相对较高，但感染效率偏低，亦可能引起免疫排斥等方面不足［8-10］。当前慢病毒（lentiviral，LV）是基因治疗的最为有效转移载体。因为该载体可以转导非分裂细胞、能稳定携带较大的DNA片段、更长的LCR片段，能减少治疗基因表达的位置效应、 制备简单且会自身失活， 安全性好。国内外基础研究显示，慢病毒介导的人β珠蛋白基因转移可以治疗中间型和重型β地贫小鼠［10-11］。但使用慢病毒载体（lentiviral vectors，LVs）的基因转移亦有一定局限性，包括慢病毒整合的随机性而可能引起干扰插入位点及其附近基因表达等一些不足。除了病毒载体系统，也有研究采用非病毒载体介导的基因转移系统，其主要优势是包装能力、无致癌危险方面。目前针对于以造血干细胞为编辑对象的基因治疗，其研究工作侧重于优化载体的构建，提高转染的效率和载体的稳定等方面［12］。
提高Hb F的水平可以减轻β地贫的严重程度［13-14］。研究显示Hb F细胞数量和水平与BCL11A、C-Myb以及HBB基因的外显子存在关联性，其中BCL11A被证明是最有潜力成为治疗靶点的基因。BCL11A基因的红系增强子（enhancer）可负向调控胎儿血红蛋白Hb F的表达。通过核酸酶基因编辑造血干细胞BCL11A红系增强子，消除其对HbF的抑制作用， 再将经过基因修饰的自体造血干细胞回输患者， 从而治愈重型β地贫［15］。美国Bluebird Bio等公司已进行相关的临床试验研究。始于2013年的一项多中心临床研究显示， 共22例输血依赖型地贫（transfusion-dependent thalassaemia，TDT）患者接受临床试验， 年龄为12至35岁，中位随访时间是26个月（15～42个月）。结果显示，所有22例患者的长期输血需求明显减少，或已完全脱离输血。细胞回输后平均在9～12个月后，患者体内Hb合成水平达到峰值。随访26个月后，13例非β0/β0基因型患者中有12例已脱离输血，总Hb升至82～137g/L；其余9例基因型为β0/β0 或基因型为β+/β+（IVS1-110纯合子）重型患者中3例患者已脱离输血，每年输血量中位值降低了73%。治疗安全性较好，无克隆性病变发展，无药物产品相关的严重不良事件的报道。且输注的基因修饰细胞的量越多效果越好。这些临床研究证明了慢病毒介导的基因治疗可安全有效地降低或消除重型β地贫患者的输血依赖［16-17］。目前，全球共有4项基于病毒转导的基因治疗β地贫临床试验在进行中。
2.2 诱导iPSCs的基因修饰 因非自身胚胎干细胞分化来源细胞的应用存在免疫排斥和法律伦理方面的问题，目前干细胞研究方向倾向于诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［18］。iPSCs的研究为地贫基因治疗提供了另一种方向。理论上，可利用患者自身的体细胞诱导成为iPSCs，然后体外利用基因编辑技术将致病基因修复，再分化成为造血干细胞，然后通过回输干细胞移植实现地贫的治疗。
该基因治疗方法目前主要有两种策略：一种是基因置换：指通过同源重组导入正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。Wang等［19］通过iPSCs诱导技术已在小鼠试验中获得成功。该方法对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不设计基因组的任何改变，但效率不高。一种是基因添加：在基因安全港（gene safe habours）的位置中导入相应的正常基因，补偿缺陷基因的功能，细胞内的缺陷基因并未除去。Pan等［20］成功利用地贫患者的羊水细胞诱导成iPSCs，而后用TALEN修正了缺陷的β珠蛋白基因，并将修正的iPSCs细胞成功向红系诱导分化。目前该团队准备进行相关临床试验研究。
总体而言，基因治疗在地贫治疗中具有良好前景，是目前的研究热点。其临床研究已经开展，结果令人鼓舞，但远期疗效和安全性仍待证明。
参考文献 （略）
（2018-11-10收稿）
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