解码生命 守护健康

作者：张航 梁加龙 陈思宇 

王占军 杨飞 崔芳 任雨婷 

刘文秀 孙中生 黄旭升

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种以上、下运动神经元变性为突出表现的慢性进行性神经系统疾病，特征表现为肌无力和萎缩、延髓麻痹及锥体束征。ALS病因不明，患者多在3～5年内死于呼吸肌麻痹或肺部感染。5%～10%的ALS患者有家族史，为家族性肌萎缩侧索硬化(familiar amyotrophic lateral sclerosis, FALS)，遗传方式可为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或伴X染色体遗传，其余为散发性，为散发性肌萎缩侧索硬化(sporadicamyotrophic lateral sclerosis, SALS)^[1,2]。基因突变在ALS的发病中起重要作用，目前已发现近30个相关基因的突变可引起ALS。其中一些致病基因已在我国ALS人群中进行了筛查，如SOD1^[3]、TARDBP^[4]、C9ORF72^[5,6]、SQSTM1^[7]、OPTN^[8]、TBK1^[9]等。2004年，Chen等^[10]发现Senataxin(SETX)基因突变可引起ALS4，本研究旨在中国SALS患者中筛查SETX基因致病突变并对携带SETX基因突变患者的临床特点进行分析。

对象与方法

一、研究对象

本研究纳入2010年1月至2014年12月间，在解放军总医院神经内科就诊，依据EL Escorial诊断标准2000年版^[11]，诊断为ALS(诊断级别为确诊、很可能、实验室支持很可能、可能)的患者311例，并选择年龄与性别匹配311名健康人作为对照。所有受试者及亲属对该研究知情并签署知情同意书，该研究得到了解放军总医院伦理委员会的批准。

二、基因筛查

从受试者外周静脉血中提取DNA，经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增后，采用二代测序筛查SETX基因的编码区，所得突变再采用Sanger测序验证以排除假阳性。序列来源GRCh37/hg19，转录本NM_015046。筛查所得突变与数据库比且通过生物信息学分析预测其致病性。

三、数据库及软件

dbSNP数据库：The Single Nucleotide Polymorphism Database (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)；ESP数据库：Exome Sequencing Project(http：//evs.gs.washington.edu/EVS/)；ExAC数据库：Exome Aggregation Consortium(http：//exac.broadinstitute.org/)；GERP＋＋(http：//mendel.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/)；PolyPhen－2(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)；Sorting Intolerant From Tolerant(http：//sift.jcvi.org/)；MutationTaster(http：//www.mutationtaster.org/)；primer premier 5(http：//www.premierbiosoft.com/)；BioEdit v7.2.5(http：//www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)；SPSS 22.0(http：//www.spss.com.cn/)。

四、统计学分析

采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，计量资料以百分率表示。采用t检验对患者的发病年龄进行统计分析。检验值P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

一、临床特点

本研究共纳入311例SALS患者，男197(63.3%)例，女114(36.7%)例，肢体起病266(83.6%)例，球部起病45(16.4%)例，发病年龄(53±11)岁，同之前报道的中国人群ALS临床特点相近^[12]，起病年龄最小16岁，最大87岁。其中携带SETX基因突变者12例，男7(7/12)例，女5(5/12)例，肢体起病10(10/12)例，球部起病2(2/12)例，发病年龄(55±13)岁。

二、筛查所的突变

通过与dbSNP、ESP、ExAC数据库对比，本研究筛查所得SETX基因编码区的非同义突变的SALS患者共12(3.86%)例，所携带突变均为杂合子。携带p.Pro1868Leu(c.5603G>A) 1例，p.Gly1401Val (c.4202C>A) 1例，p.Pro1331Leu (c.3992G>A) 1例，p.Arg1010His(c.3029C>T) 1例，p.Glu756Val (c.2267T>A) 1例，p.Met627Thr (c.1880A>G) 1例，p.Leu564Val(c.1690A>C) 1例，p.Asp448Gly (c.1343T>C) 1例，p.Asp2372Asn (c.7114C>T) 2例，p.Asn144Ser(c.431T>C) 1例，p.Leu916Ile (c.2746C>A) 1例(表1，表2)，未发现已报道的致病突变。经预测软件分析，5(1.61%)例患者携带的SETX基因突变具有较高的致病性，分别是p.Pro1868Leu(c.5603G>A)、p.Pro1331Leu (c.3992G>A)、p.Glu756Val (c.2267T>A)、p.Leu564Val(c.1690A>C)、p.Asn144Ser (c.431T>C),主要原因为这些突变的位点在进化上较为保守且SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster的预测结果中至少两项提示为致病性突变且对照组的健康人群中未发现这些突变。

表1 筛查所得SETX基因突变

表2 SETX突变致病性分析

三、发病年龄比较

携带SETX基因突变的12例患者的平均发病年龄与总体相比差异无统计学意义(P＝0.827)。

讨论

SETX编码的蛋白具有DNA/RNA解螺旋酶的活性，在DNA/RNA代谢及维持基因组的完整性方面发挥作用^[13,14]，转录调控中可以调节RNA聚合酶Ⅱ的活性，有助于信使RNA的剪切与拼接^[13]。但突变如何影响蛋白质功能最终导致ALS的发生目前仍不清楚。之前有报道SETX基因突变可引起ALS4^[10]，特点为常染色体显性遗传，儿童或青少年期发病，推测SETX突变可使ALS患者发病年龄提前。本研究患者5于23岁发病，发病年龄上较为符合ALS4，但该患者无家族史，其携带p.Asp448Gly突变非保守，致病性相对较低。

之前一些SETX基因筛查研究显示各地区ALS患者SETX基因致病突变携带率有较大差异。其中日本0.85%^[15]、美国8.12%^[16]、爱尔兰2.48%^[17]。分析造成这种差异的原因主要有：一是种族差异；二是ALS为罕见病，样本量偏小导致研究结果差异较大；三是通过预测软件确定突变致病性的标准各个研究略有差异。

SETX基因突变不仅可引起ALS，还可引起脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxia，SCA)^[18]，目前已报道的可引起ALS的SETX基因突变主要有p.Thr3Ile^[19]、p. Leu389Ser^[10]、p. Cys1554Gly^[20]、p. Lys2029Gln^[20]、p. Arg2136His^[10]，p. Ile2547Thr^[20]，p.Thr1118Ile^[21]等。本研究中筛查所得SETX基因突变全部为非同义突变，其中p.Leu916Ile (c.2746C>A)在dbSNP、ESP、ExAC数据库中均无报道，为新发现的突变，但该位点非保守，且SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster三个软件分析皆为非致病性突变。p.Pro1868Leu (c.5603G>A) p．Pro1331Leu(c.3992G>A)、p.Glu756Val (c.2267T>A)、p.Leu564Val (c.1690A>C)、p.Asn144Ser(c.431T>C)可能具有较强的致病性，但其他突变位点的致病性也不可忽视，近来有报道ALS的发病可能由多个基因突变共同引起^[22]，在大规模ALS致病基因筛查中也发现ALS患者可携带多个致病基因突变^[15,16]。

本研究共纳入311例中国SALS患者筛查SETX基因突变，并选取了311名健康人群作为对照，在中国SALS患者中筛查SETX基因突变情况，并对携带SETX基因突变患者的临床特点进行了分析，之前国内研究罕见相关报道。共筛查出突变位点11个，其中高致病性突变位点5个。12(3.86%)例患者携带有SETX基因突变，其中5(1.61%)例携带高致病性突变。提示SETX基因突变可能是中国人群部分SALS患者的病因之一。通过与对照组对比和预测软件分析，其中5个位点的突变可能具有较高的致病性。但确切的致病性还需进一步的细胞学实验及动物实验来验证。

选自中华医学杂志, 2018,98(33)