解码生命 守护健康

　　人类基因组变异的范围大小可以从单个碱基到整条染色体不等，主要可分为染色体异常、拷贝数变异(copy number variantions，CNVs)、以及单个或多个碱基的变异(single/multiple nucleotide variations，SNVs)。根据变异大小的不同，经典的基因检测方法有染色体核型分析、基因芯片、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation－dependent probeamplification，MLPA)和一代、下一代测序等。拷贝数变异(copy number variation，CNV)的定义是一段大小至少为1 kb的DNA序列在拷贝数上有所不同，在基因的总变异中占20%。CNV是基因组疾病(genomicdiseases)的重要分子基础，包含了基因组的微缺失和微扩增。染色体基因组芯片分析(chromosomalmicroarray analysis，CMA)可以在全基因组范围内同时检测染色体拷贝数变异，因其通量大、分辨率高，已被应用于多种基因组疾病的临床诊断和研究，为分子诊断平台的完善提供了重要的技术支持。

一、基因芯片与一代测序、下一代测序

　　经典的Sanger测序法对所有已知相关基因逐一筛查，费时、费力且价格昂贵，因而难以在科研和临床实践中切实开展。高通量测序技术可以同时对数百万条短序列片段进行测定，使得对一个物种的转录组、基因组和表观遗传组进行全貌分析成为可能，是对传统测序技术的一次革命性改变，因此也称为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)。NGS具有高通量、灵敏度高、再现性好、成本低、省时等优点，大大提高了诊断效率。近年来，NGS在部分发达国家儿童遗传性疾病的诊断中已得到广泛应用，我国已有将NGS应用于遗传疾病基因检测的成功案例，如高苯丙氨酸血症、遗传性骨病等遗传代谢病NGS平台的建立。CMA和一代测序、下一代测序各有侧重，目前三种检测方法还不能相互替代。CMA主要针对全基因组的微重复和微缺失，而测序主要针对点突变等。

二、基因芯片的种类和原理

　　根据不同的设计原理，基因芯片主要分为两大平台：比较基因组杂交芯片(array－based comparative genomichybridization，aCGH)和单核苷酸多态性微阵列芯片(single nucleotide polymorphism array，SNParray)。每个芯片的分辨率和检出率受限于芯片上基因组的覆盖率，探针长度以及探针之间的距离，以及用来确定插入和缺失标准的具体统计方法。临床医生在申请CMA时，应了解不同的临床平台、不同芯片间分辨率的差异，以及每种芯片所提供的信息。aCGH技术能够准确的检测出CNV，但无法识别易位或倒位等染色体重排，或者区分染色体三体和罗伯逊易位，而SNParray除了能够检测出CNV外，还能够检测出大多数的单亲二倍体和一定比例的嵌合体。近年来，两大平台不断改进技术，同时涵盖CNV和SNP的芯片具备双重优势，在检测的敏感性、特异性和可靠性等方面有了很大的改善。

三、应用指征和优缺点

　　目前，对于以下几类疾病，建议CMA应为一线检测手段：(1)非已知遗传性综合征的多发畸形(MCA)；(2)不明原因的发育迟缓/智力落后(DD/ID)；(3)自闭症(ASD)。另外，一部分身材矮小、癫痫、肥胖、先天性心脏病等也是CMA的应用指征，但有待进一步临床规范共识。

　　与染色体核型分析相比，CMA不需要进行细胞培养，分辨率高出进千倍，几乎可用于任何组织的DNA分析。CMA可在全基因组范围内同时检测到很多种染色体不平衡导致的遗传性疾病，可检测到染色体的微重复和微缺失，并能客观准确的界定CNV的区间及大小。CMA快速方便，具有高度的灵敏性和准确性，可同时检测多种疾病或多个检测位点。Scott等指出，在10%的水平上，可检测到额外染色体的嵌合现象，而部分染色体的缺失或复制的嵌合现象只能在20%～30%的水平上进行检测。CMA具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强和反复利用等优点。

　　2013年更新的ACMG指南提出，自最初开发以来，CMA技术已得到极大的改进，但此技术仍存在一定的局限性。CMA不能检测染色体易位、倒位及复杂性重排。当怀疑存在染色体非整倍体时，例如21三体、18三体或者性染色体非整倍体时，常规的染色体核型分析可能更适合。对于已明确染色体变异区域的某些综合征(如威廉姆斯综合征)，利用单独探针的FISH检测更为经济有效。另外，CMA技术不能检测<10%的低水平嵌合体，不能检测出点突变和小片段插入/缺失。CMA技术也可能检测出临床意义不明的CNV，这时候需要检测父母的基因组才能得出相应的结论。目前CMA技术不能检测低于探针覆盖和检测能力以下的重复和缺失、基因表达异常和甲基化异常。

四、CMA的临床应用

　　2010年10月，美国医学遗传学和基因组学学会(American College ofMedical Genetics and Genomics，ACMG)颁布了CMA的临床应用指南。随后加拿大、澳大利亚等也相继发布了指南，推荐CMA作为非已知遗传性综合征的多发畸形、不明原因的发育迟缓/智力落后、自闭症等的首选检测技术，替代染色体核型分析技术。

　　Miller等分析了21 698例患有发育迟缓、智力障碍(DD/ID)、多发性先天异常(MCA)和自闭症(ASD)患者的CMA检测结果，并建议将CMA作为上述疾病的一线检测方法。Hochstenbach等总结了36 325例DD/ID患者的CMA结果，发现其中19%存在基因组的拷贝数异常。Xiang等利用CMA技术对法国32例不明原因ID患者进行检测，发现有14.4%患者存在致病性CNV。2007年Sebat等采用寡核苷酸探针芯片技术在ASD患者中检测到新发生的CNV，证明CNV是ASD发病的重要遗传病因。Shen等也提出，对于患有ASD的患者，CMA应作为一线检测方法。

　　我们曾对123例DD/ID患儿分别进行常规染色体核型分析和CMA检测，发现CMA技术检测的拷贝数异常(33.3%)明显高于常规染色体核型分析(4.65%)，且染色体核型分析阳性患者经CMA验证发现有些诊断不完整。2010年，细胞分子遗传学芯片国际标准(The International Standard of Cytogenomic Array，ISCA)联合会对33个已发表的共21698个病例的CMA检测结果进行分析，发现常规染色体核型分析检测发育异常的阳性率为3%，荧光原位杂交(FISH)的阳性检出率为2.4%～2.6%，而CMA的阳性诊断率为12.2%。国外许多研究资料表明，CMA技术对于DD/ID和MCA的检出率基本在13%～20%。

五、CMA临床应用面临的主要问题和挑战

　　对全基因组CMA检测的临床验证应有别于对单基因病或特定综合征的检测方法，要求验证每一探针的性能是不现实的，也没有必要。实验室应根据所选择的芯片平台，界定平台特异性检测最小变异(CNV，AOH)的能力，进而用携带有大于最小变异的阳性样本进行验证实验设计，采用规范的操作流程，以证明平台检测CNV及AOH的敏感性、特异性及可重复性。

ACMG在2011年发布的CMA结果分析指南中，对此进行了很详实的阐述。　　 (1)CNV的片段大小：一般来说，CNV的片段越大，越具有诊断意义。但是大片段的CNV也有可能是良性的，而小片段的CNV一旦涉及关键基因也有可能具有临床意义。这需要结合芯片类型、临床资料、随访结果和临床经验等进行综合判断。

(2)CNV区域内基因组的含量：CNV中是否存在功能基因，是分析CNV有无临床意义最主要的因素。包含的基因越多，越有可能具有临床意义，但包含基因的功能和致病性更为重要。如果认为临床表型和该CNV区域内的某些基因的的缺失或重复有关，那么需要从OMIM或者Pubmed数据库中查询该基因是否与此临床表型相关的证据。

(3)明确缺失和重复：一般缺失比重复更有临床意义。同一基因的重复或缺失可引起不同的基因组病。剂量敏感基因扩增时也可能有致病性。(4)新发(de novo)变异：新发变异比父母遗传下来的变异更有可能具有致病性。(5)与本地数据库或者国外相关数据库进行比较，正常人群中出现类似的CNV变异越多，良性的可能性越大。常用的数据库有：CNV致病性数据库(DECIPHER)，多伦多基因组变异数据库(DGV)。

　　当发现致病性CNV或临床意义不明确的CNV时，实验室报告必须提出遗传咨询或指导的建议。如果无法确定CNV的临床意义，建议在报告中给予相关医学文献对该CNV的持续监测，有利于今后阐述检测结果的临床意义。