CRISPR基因编辑技术和效率检测快速入门

2017-07-13 20:06:34武汉佰蕾真生物科技有限公司

最初作为自然界细菌防御系统的CRISPR/Cas9 技术正在成为治疗血液病、肿瘤、遗传病等疾病的有利手段。同时基因编辑技术在模式生物构建，动植物育种和细胞治疗方面也有广泛的应用。文献已经上千篇了，它作为基因功能研究的一种技术手段更是不言而喻，所以说基因编辑技术正在走近每位life science研究者一点也不为过。

CRISPR/Cas9的结构

CRISPR/Cas9系统由2部分组成，一个是参与识别靶序列的引导序列small guide RNA (sgRNA)，另一个是负责切割靶标DNA的Cas9核酸酶，它在sgRNA的引导下靶定到具有下游前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)的特定基因组序列并进行切割¹。这个起作用的蛋白酶加RNA的复合体有不同的方式导入细胞中，下图是常见的共转表达sgRNA和Cas9的载体。

哺乳动物细胞中gRNA (chemricRNA) 介导Cas9 基因定点编辑²

CRISPR/Cas9是如何编辑基因的？

Cas9酶在PAM序列附近切割DNA，这激活了DNA双链断裂(DNA double-strand breads, DSB)修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HR)两条途径，导致靶DNA发生碱基插入或删除(indel)，实现基因敲除、特异突变引入和定点转基因。

非同源末端连接(NHEJ)是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA修复重连的过程中会

发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活，实现目的基因敲除。

同源重组修复(HR)是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因的替换。HDR的效率比NHEJ要低。

https://wenku.baidu.com/view/5167109a0b1c59eef9c7b441.html

编辑效果如何检测？

不同的基因位点、细胞类型、转染方法、sgRNA和Cas9酶等因素都会影响基因编辑的效率，因此不同实验室的编辑效率会有非常大的差异，大家也都在努力优化高效特异的系统。

如何快速、准确地评估编辑效率？如何在低编辑效率时（如干细胞的编辑）快速挑选到阳性克隆？你需要更先进的方法。

以下对几个不同的检测方法作了比较，Bio-Rad 微滴数字PCR（ddPCR）技术在速度、实验操作便捷性、检测灵敏度以及定量准确性上均有明显优势³。

各方法原理简介

1.Bio-Rad ddPCR 技术将单个样品分成20000个微滴来分析，极大降低了野生型序列和其它背景序列对扩增的干扰，并采取逐个微滴直接分析来算出目标序列的拷贝数，无需标准曲线，无需Ct值，实现精准的绝对定量。

http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/introduction-digital-pcr

并且，Bio-Rad还提供编辑位点检测Assays(引物和探针)的在线设计和产品订购，让您的实验更轻松。基因编辑Assays的设计原理和测试结果可点击“阅读原文”查看。

2.限制性核酸内切酶法。该方法的特点是选择靶标位点含限制性内切酶识别位点的sgRNA。当靶标位点被切割后，相应的限制性内切酶识别序列会被破坏，由此可用对应的限制性内切酶，检测DNA靶标是否被切割。或者在提供的同源供体DNA中，插入限制性核酸内切酶识别碱基序列，使其通过同源重组插入到靶标位点。再通过限制性内切酶进行酶切，以此方法来判断靶标位点是否发生同源重组。

克隆1、5和7是缺失的杂合子，4是缺失的纯合子

http://www.ebiotrade.com/newsf/2015-8/2015813134201237_2.htm

3.错配核酸酶切割分析

常见的是使用T7E1 内切酶，它识别错配的杂合双链。如下图细胞样品中含未编辑的野生序列和编辑后的突变序列，经PCR扩增后再解链重新退火会产生错配的杂合双链，T7 酶切后出现2个短片段。

http://www.igenebio.com/product/indelcheck-detection-system/

下图是2个基因经CRISPR-Cas9编辑后T7酶切PCR产物结果。对照细胞（-）的酶切产物应只有一条带，对应没有被切开的基因组PCR产物。转染了有活性的CRISPR-Cas9克隆的实验组（+），酶切产物跑胶出现3条带：1条来自未被编辑的细胞的基因组PCR产物，其余两条较短的条带为长度符合预期的错配酶切产物。