以钙调控蛋白为靶点的心力衰竭基因治疗
心力衰竭(心衰)是大多数心血管疾病的最终结局及最主要的死亡原因，尽管药物和器械治疗取得了一定进展，但重症心衰患者年病死率仍高达50%，与恶性肿瘤相近，心衰治疗仍是世界性公共卫生的重点及难题。大量证据表明心衰的病理生理过程中，心肌细胞内存在钙稳态失衡，这与心衰及其心律失常的发展密切相关。早期基础研究已证实了通过基因水平调控心肌细胞内钙稳态失衡治疗心衰的有效性，随着近年来腺相关病毒(adeno–associated virus，AAV)载体在安全性及心肌选择性等方面的巨大突破[1]，基础研究成果迅速向临床转化，这为心衰的治疗带来了希望，但同时也伴随着怀疑与挫折。本文将从基础到临床，对以钙调控蛋白为靶点的心衰基因治疗策略的现状以及存在的争论和问题进行探讨。
一、钙稳态失调及基因治疗靶点
心衰时钙稳态失调涉及心肌细胞内钙循环的各个环节，并造成肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)内钙储备下降，导致在随后的心动周期中SR钙释放量降低，心肌细胞收缩性受损。一般认为，心衰时SR钙储备下降是SR钙摄取泵(calcium–pump ATPase，SERCA2a)功能下调、钠钙交换体(sodium–calcium exchanger，NCX)功能上调及钙释放通道(cardiac ryanodine receptor, RyR2)功能紊乱所致舒张期钙离子渗漏的综合结果[2]。
理论上，任何增加SR钙储备的措施，均可改善心衰时心肌细胞的收缩力。SERCA2a是调节SR钙储备最为关键的调控蛋白，其功能是将胞浆内的钙重新泵回SR。而与之相邻的受磷蛋白(phospholamban, PLN)则是其抑制性调节蛋白。研究证实增强SERCA2a功能或者抑制PLN功能均可使SR钙储备上调。腺苷酸环化酶6(AC6)作为另一种调控SR钙储备的因子，由G蛋白系统激活产生并催化三磷酸腺苷(ATP)转变为环磷酸腺苷(cAMP)。AC6水平上调一方面可以改善SERCA2a对钙离子的亲和力，另一方面能促进PLN磷酸化，解除PLN对SERCA2a的抑制效应，达到增加SR钙储备的效果。此外，S100A1分子亦能改善SR钙储备，它是一种对钙离子具有高亲和力的钙结合蛋白，主要以钙离子依赖的方式与RyR2相互作用，并能够通过稳定SERCA2a–PLN复合体的方式调节SERCA2a功能，达到增强SR钙摄取以及减少RyR2钙漏的作用。心肌细胞内钙循环及调控详见图1。
图1 心肌细胞内钙循环及调控示意图( 动作电位引发心肌细胞膜去极化，导致L型钙通道开放，细胞外钙离子进入心肌细胞内触发RyR释放SR内钙离子，心肌细胞收缩，即心肌细胞兴奋收缩耦联，心肌舒张期间胞浆中部分钙离子被SERCA2a重新摄取进入SR，另一部分通过钠钙交换体泵出细胞，PLN调节SERCA2a功能，当其磷酸化后可解除对SERCA2a的抑制作用，NE作用于GPCR系统激活AC6及cAMP–PKA通路，后者与CaMKⅡ、S100A1等调节PLN磷酸化过程)
二、心衰基因治疗的实验基础
1．SR钙储备增加与心功能的改善：
Hajjar等[3]首先证实SERCA2a基因过表达可增加心肌细胞内钙库储备。心衰时心肌细胞SERCA2a的mRNA及蛋白水平均下调，上调SERCA2a表达水平可显著改善细胞收缩及舒张功能[4]。在羊心肌梗死后心衰模型中，AAV6介导的SERCA2a过表达可明显改善心肌收缩力并抑制心室重构进程[5]。该结论已被多种动物模型反复证实[6,7]。此外，SERCA2a基因过表达还能改善心肌细胞的能量储备[8]，进一步纠正心衰代谢紊乱。
当前研究表明，PLN的过表达可使SR对钙离子摄入减少，心肌收缩性降低，心功能恶化。与此相反，应用PLN RNA干扰技术可使心肌内PLN表达减少，显著改善心衰动物模型的收缩及舒张功能[9]。因此，PLN水平下调可提升心肌细胞SR钙储备本质上是通过增强SERCA2a功能实现的。
AC6在心肌细胞内过表达可使cAMP水平升高，SERCA2a功能增强，心肌细胞内钙储备提升，心功能显著改善[10]，并使病死率明显降低[11]，这已被小动物模型多次证实。在大动物模型中，通过冠状动脉内递送Ad–AC6基因策略，亦能够观察到左心室功能明显改善及左心室重构进程减缓[12]。
SR钙储备提升能有效增强心肌细胞收缩力，从而达到治疗心衰的目的。然而部分学者对该策略持谨慎态度，一是临床上诸如强心甙类或磷酸二酯酶抑制剂等增强心肌收缩力的药物，虽可明显改善心衰症状，但对其长期预后并无显著影响[13]，而具有负性肌力作用的β受体阻滞剂却能改善心衰患者预后[14]。二是SR钙储备降低仅是心衰时心肌细胞钙稳态失衡的一个方面，单纯增加SR钙储备，可能造成RyR2舒张期自发性钙漏增加，形成触发性心律失常[15]。
2．S100A1与多途径钙调控：
S100A1作为一种高亲和力钙结合蛋白，可通过SERCA2a、PLN、RyR2等多种途径发挥其调控钙循环的功能。心衰时S100A1的表达水平下调，利用AAV6–S100A1基因治疗策略增加其表达，能够减缓左心室重构并明显改善心脏功能[16]。同样在大型动物模型中，利用AAV9–S100A1基因治疗策略上调S100A1表达水平，依然能够显著改善心肌细胞的能量代谢，增强心脏收缩及舒张功能[17]。S100A1过表达可增加SR钙储备，这与其增强SERCA2a功能及减少舒张性RyR2钙漏密切相关[18]，而后者可降低触发性心律失常发生的可能性。
三、心衰基因治疗的临床进展
SERCA2a基因治疗心衰在基础研究中开展得最早、最深入，因此心衰基因治疗的第1个临床试验(CUPID)采用了SERCA2a基因。其Ⅰ期试验入选了9例终末期心衰患者，采用冠状动脉内递送AAV1–SERCA2a基因，经过6个月的随访，结果显示患者的症状、生物学标志物及左心室重构参数均有明显改善[19]。近期CUPID Ⅰ期试验发布其随访36个月的数据，结果显示治疗组心血管事件发生率较对照组低[20]。其Ⅱ期临床试验采用随机双盲、安慰剂对照及基因剂量递增策略，纳入纽约心脏协会(NYHA)心功能Ⅲ～Ⅳ级的患者39例，给予6×1011、3×1012和1×1013 vp(viral particles，病毒颗粒)3种剂量的治疗基因，经过12个月的随访，发现高剂量治疗组的患者全部达到心功能改善的标准，而中、低剂量组只部分达标[21]，提示病毒剂量与治疗效果之间存在一定的量效关系。值得注意的是，在长期的随访评估中，未出现与AAV治疗相关的不良事件，证明了AAV介导的基因治疗的长期安全性。
此后，CUPID 2(Ⅱb)临床试验在更大样本人群中进行了验证。该研究共纳入243例年龄18～80岁、NYHA心功能Ⅱ～Ⅳ级、左心室射血分数≤35%的慢性收缩性心衰患者。患者随机分入AAV1–SERCA2a组(n＝121)和安慰剂组(n＝122)。该研究主要终点为心衰复发的时间，次要终点为发生全因死亡、心脏移植等终末期事件的时间。平均随访18个月，结果显示AAV1–SERCA2a治疗并未改善复发率(HR＝0.93，P＝0.81)及出现终末期事件的时间(HR＝1.27，P＝0.40)，亦未出现安全性问题[22]。
CUPID 2(Ⅱb)的非阳性结果促使我们对心衰基因治疗策略进行更深层次地思考：(1)心衰治疗效果与病毒剂量存在量效关系[20,21]，CUPID 2(Ⅱb)试验中采用的病毒剂量为1013 vg(vetor gonome，载体基因组)级，此剂量或许尚不足以取得临床治疗效应。(2)基因的转录和翻译均受到细胞的调控与修饰，心衰时心肌细胞的内环境改变，对SERCA2a基因的调控与修饰很可能限制了其表达效应[23]。目前尚未有证据证实心衰患者SERCA2a基因治疗后，心肌细胞SERCA2a蛋白表达增加。(3)CUPID2(Ⅱb)试验采用了顺向冠状动脉内递送方式，这种方式会使病毒载体随血流迅速播散，载体浓度迅速降低，削弱了基因的治疗效应。经冠状窦逆向给药方式允许的载体压力梯度更高，可改善基因在心肌组织内转导的效率[24]，提供了更多的给药途径。(4)CUPID2(Ⅱb)试验采用巨细胞病毒启动子，作用较强但心肌特异性不足。肌钙蛋白或肌球蛋白轻链启动子凭借良好的心肌特异性表达已应用于各类研究。尽管其效应弱于巨细胞病毒启动子，但其在心肌细胞内能够持续表达上调[25]，这为增强基因在心肌细胞内的特异性表达提供了一条途径。(5)病毒载体亦存在改良空间。人体自然感染AAV后可产生中和抗体导致不能耐受该治疗，而利用病毒工程技术改变病毒特性[26]或筛选中和抗体抵抗性AAV[27]，可扩大适应证人群。
尽管当前心衰基因治疗遇到了一定挫折，但CUPID系列试验皆未出现安全性问题，这有力地证明了基因治疗的安全性，也为未来进一步研究提供了安全保障。
以钙调控蛋白为靶点是目前心衰基因治疗的主流策略。除CUPID试验外，近几年还有2项关于SERCA2a基因治疗的临床试验刚刚开展，即SERCA–LVAD和AGENT–HF。前者用于评价SERCA2a基因在应用左心室辅助装置的慢性心衰患者中的治疗效果，而后者用于评估SERCA2a基因在严重心衰患者中对于心室重构的治疗效果，二者均于2016年公布结果。此外，目前正在进行的心衰钙调控基因还包括AC6基因，以及准备开展但尚未登记注册的S100A1基因[28]。
综上所述，以钙调控蛋白为靶点的心衰基因治疗已从基础研究走向临床研究，尽管遇到一定挫折，但以AAV为载体进行基因治疗策略的安全性已得到证实。今后几年，多个以钙调控蛋白为靶点的心衰基因治疗临床试验结果将陆续公布，对此我们保持谨慎的乐观，这些临床研究将为重新评价和审视心衰基因治疗策略提供更多的依据。此外，作为心血管领域少有的基因治疗研究，其必将促进基因治疗在其他心血管疾病中的应用。
参考文献（略）
