基因工程抗体，能否颠覆这个免疫抗体的时代？

2017-06-02 08:44:41ScienceLondon未止科技

近日，Abcam向美国抗体公司AxioMx支付了最终的450万欧元，完成了对后者总计3640万欧元的收购。AxioMx，成立于2012年，是一家专注于使用噬菌体展示技术替代传统抗体生产技术的重组抗体研发及生产公司。此次收购，使得Abcam完善了重组抗体的生产技术，与已有的传统抗体制备技术相辅相成，从而进一步完善抗体生产领域的布局。目前，abcam已经拥有超过1万种RabMAb重组兔单抗（来源：abcam官网）。

那么，重组抗体是否真的有潜力颠覆现有的动物免疫抗体市场呢？本文将详细介绍关于重组抗体的基本技术、应用领域、市场概况以及未来前景。

重组抗体简介

重组抗体（recombinant antibodies，rAbs），是使用重组DNA技术在体外构建的，不受免疫系统限制而生产的单克隆抗体。由于重组抗体是利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子，因而也被称为基因工程抗体。

生物学原理：从生物学原理的角度看，只要分离出抗体基因，然后并入质粒DNA载体中，将得到的合成质粒转移到表达宿主，如细菌、酵母或哺乳动物细胞系中，即可在体外表达得到重组抗体，进一步经过分离纯化，变成了高效纯化的重组抗体。一般而言，但凡单克隆抗体适用的场合，重组抗体也完全适用。

发展历史：重组抗体的发展经历了鼠源单抗（monoclonal antibody, McAb）、人鼠嵌合抗体（chimeric atibody）、人源化抗体和全人抗体四个阶段。大多制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生。在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。嵌合抗体是最早制备成功的基因工程抗体，它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。人源性抗体是将人抗体的 CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的 CDR ，由此形成的抗体，鼠源性只占极少。完全人源化抗体采用基因敲除术将小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。

生产工艺流程：哺乳动物重组抗体在刺激动物免疫系统制备单抗的基础上进行，通过构建稳定表达细胞系，对上述实验得到的抗体测序得到抗体的序列。在已知抗体基因序列的前提下，将基因序列克隆到相应载体上，利用哺乳动物细胞进行重组抗体的表达，筛选可稳定表达的细胞系，即可满足后续对抗体的大量需求，节约后续实验时间。通过序列进行重组抗体表达，针对特定基因只能生产单抗。

图示：哺乳动物细胞重组抗体生产

重组抗体的特点

重组抗体的DNA序列可以通过克隆抗原特异的抗体基因，或从噬菌体文库中筛选获得。重组抗体本质上是单克隆抗体，并和常规的单克隆抗体和多克隆抗体都不同，重组抗体的主要优点包括：
1）重组抗体的序列可以被修饰以适应于具体需要；
2）抗体的产生不依赖于宿主动物的免疫特性；
3）重组抗体不含有动物病原体；
4）体外表达的抗体在批次之间具有非常好的一致性。

重组抗体VS传统动物免疫的优劣对比

通常，通过传统动物免疫来制备多抗和单抗。多克隆抗体是通过收集经过目标抗原刺激动物获得免疫后的血液而制成的（只要这只动物还活着，就能够一直提供多克隆抗体）；单克隆抗体是通过宿主动物接受目标蛋白免疫，然后提取出能识别并对该抗原发生响应的B细胞，使其与骨髓瘤细胞发生融合，从而成为可永久培养的细胞，不断产生目的抗体。

相比之下，重组抗体不同于传统的单克隆抗体，因为它们的制备不需要动物。通过检测产生该抗体的基因序列（通过对动物的免疫细胞进行测序、或自己设定序列，检测产生的蛋白是否符合目标蛋白）；再将该基因插入到合适的细胞株中产生抗体。由于抗体序列是确定的，即使原始细胞株死亡或发生突变，也能通过基因插入，产生需要的细胞株。

传统的免疫动物生产的抗体，是获取动物血清纯化得到的，如果用于药用，人体往往会产生排异反应。利用重组技术生产抗体，不仅能够满足抗体的大规模生产需求，同时，重组抗体药物的发展已成为目前生物制药的主流之一。

传统的生产抗体的方式是用抗原刺激动物免疫系统，这种方式需先制备抗原，且利用这种方法生产抗体难以满足大量的生产（需求大量的实验耗材和时间）。而哺乳动物细胞生产抗体的方式有一定的优势：
（1）已知抗体的基因序列：将序列克隆到表达载体上，导入到哺乳动物细胞体内培养，通过一系列的筛选，最终获得能够稳定生产此抗体基因的稳定细胞系，并能够在后续实验中稳定长期生产。
（2）未知序列的抗体大量生产：先刺激动物免疫系统得到少量抗体通过测序得到抗体序列，通过哺乳动物细胞重组抗体表达筛选稳定表达的细胞系，满足大量生产需求。

综上，将两者的优劣进行对比，汇总如下
多抗
优点：制备容易；成本较低；应用广泛
缺点：需要动物；抗体结构较不明确

单抗
优点：特异性高；重复性好；抗体结构明确
缺点：需要动物；制备成本高；生产周期长（往往几个月）；杂交瘤需要进行单细胞克隆，过程繁琐

重组单抗
优点：特异性高；重复性非常好；抗体结构明确；批量生产不需要动物；比单抗需要较少纯化的抗原可以开始生产；生产周期短（往往数周即可）；理论上可构建针对任何抗原的重组抗体，包括人源和高度保守抗原（如未被小鼠的免疫系统识别为外源的抗原），非免疫原性（不引起免疫应答），以及毒性分子（不能注入鼠标宿主）；规避了鼠单克隆抗体引起的人体免疫反应；可以以几种形式生产（Fab片段、单链可变区片段scFv、双抗体（聚体scFv）；可以在几个宿主中表达（大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母、真菌、昆虫细胞、甚至植物）；适合与药物和毒素融合，因此可用于治疗；规避了以杂交瘤的形式永生化B细胞的需要；可以容易地优化，因为它们的核酸序列被定义并且易于获得；选择过程是高度灵活的，并且可以调整以有利于具有特定性质的抗体的分离。
缺点：尽管批量生产无需动物，且成本低，但前期制备和生产（转入批量生产前）仍然需要动物免疫，且成本高。

重组抗体的应用情况

目前重组抗体主要是作为以识别目的为主的单克隆抗体或多克隆抗体的替代品，用于试验和研究，因为重组抗体可以降低批量生产成本或规避免疫原性的问题。较常用的应用技术有：免疫印迹、流式细胞术、免疫化学等 - 这其中重组抗体展现了巨大的发展潜力。

一些重组抗体已被用作实验试剂。例如，硫代酪氨酸的重组抗体。也有一些重组抗体用于筛选和鉴定杂交瘤品质和噬菌体展示技术，以用于大规模抗体生产和效用评估。

此外，重组抗体可以用于作为药物进行治疗。重组抗体，在设计之初，可被设计成适合与药物和毒素进行融合的结构，从而应用于治疗目的。

重组抗体的科研市场概况

尽管有关抗体的大多数文献，仍然采用通过杂交瘤培养或腹水方法生产的单克隆抗体，或是通过宿主动物产生的多克隆抗体，但已有不少公司进行生产和销售重组抗体，并应用于科研研究，如Life Technologies的 GFP 抗体 (G10362) ，它用于免疫沉淀实验，去检测脱酰氨基作用在Bcl-xL降解中的调节作用。

2005年Upsate公司（现属于EMD Millipore）开发出重组克隆号为4G10® ( 16-204) 的生物素偶联的磷酸化酪氨酸抗体。这个克隆号及其不同偶联物的抗体是迄今为止被引用最多的重组抗体。其他重组抗体则是四个大型的重组抗体公司的产品： Life Technologies公司的ABfinity、AbD Serotec 公司的HuCAL、Miltenyi Biotec公司的REAfinity抗体、和Creative Biomart公司的抗体。

ABfinity抗体是具有两个轻链和重链的完整IgG分子的抗体。“ABfinity™抗体具有以下特点：重组抗体；由免疫动物生产；具有筛选功能；并且可以将免疫原特异的抗体基因克隆进高表达量载体。这种抗体的生产方式是：在哺乳动物细胞中大规模表达，并利用蛋白A进行纯化。这些重组抗体在哺乳动物表达系统中表达，但是也出现抗体从血清中分离或由杂交瘤产生时的一些相似情况。完整的IgG大小为150 kDa，还原可生成〜25 kDa轻链和〜50 kDa的重链。”

自2008年以来，HuCAL重组抗体一直在被引用。HuCAL重组抗体的生产技术是基于一篇2000年，Knappik A等人发表的名为“基于模块保守框架和三核苷酸随机化CDRs而全合成的人源组合抗体文库（HuCAL）”的文章。目前应用HuCAL平台已生产了大量潜在的治疗抗体。目前，有292种HuCAL重组抗体产品，其中包括了一些识别抗体药物的抗体。

Miltenyi Biotec旗下的品牌REAfinity抗体在售的大概有300种重组抗体。每个REAfinity抗体是由单一类型的重链和单一类型的轻链组成，并且使用突变的人源IgG1作为Fc区域以消除与内源Fcγ受体的亲和力。

Creative Biomart也供应400多种重组抗体，其生产方式和HuCAL的scFv片段生产的过程类似。

利用文库生产的重组抗体，具有特异识别多种抗原的潜力。然而现状是，重组抗体作为实验试剂未被充分利用。几个供应商提供的重组抗体，作为实验试剂，往往是通过专有程序（proprietary processes）生产的。也许这是当前重组抗体未曾普及的重要原因之一。

重组抗体技术的未来前景

尽管多克隆抗体具有广泛可用性，仍然是目前研发最便宜的抗体，适用于制备一些研究较少的抗体。但随着目标蛋白结构和功能的不断明确，以及临床转化的需求，重组克隆抗体也将大有可为。

重组抗体可再现（reproducibility）性质让研究人员不再需要评估每个抗体。重组抗体也能被改造成不同的形式，适用于特定应用。如前文所述，由于传统免疫方式存在的局限性，科研抗体的可重复性问题困扰大家很长一段时间了（详见：【深度】科研抗体的水究竟有多深？起底抗体产业最大隐忧），饱受学术界专家的诟病，以至于抗体验证成为了行业内的热门话题（详见：【重磅】Nature: 抗体评分系统或将诞生，行业风暴一触即发）。而重组抗体，正是解决这个问题的关键所在。

另外，组蛋白翻译后修饰的重组抗体不仅大大加速并改善了表观遗传学研究，还有望实现新的研究突破。

瑞士苏黎世大学（University of Zurich）蛋白质工程学家Andreas Plückthu等人也认为，单克隆抗体和多克隆抗体最终会被“结构更明确”的重组抗体完全取代。他表示，许多蛋白质不能被现有的试剂识别，这是因为使用了结构不明确的多克隆抗体，因此他建议为什么不使用一些基因可识别或存储的试剂呢？

最后附上重组抗体的总结图：

（后台回复“重组抗体”可以看高清大图）