突破基因融合检测“金标准”，新一代技术应当具备这些能力

2017-07-14 08:12:45贝壳社

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编者按：本文根据恒特基因首席技术官陈力博士在贝壳社上海沙龙上的演讲整理，原题为《AMP锚定多重扩增技术对基因融合的检测》，内容有删改。以下为正文：

大家好，我是恒特基因的首席技术官和联合创始人陈力。

今天我主要会谈一些病理的东西，但也会谈一些早筛。我们大家都知道，一般来说一个新技术出现的时候，用什么判断它的好坏？必须是把这个技术和被认为已有最可靠的技术进行比较，这个已有最可靠的技术被称之为金标准。做基因融合的金标准是什么呢？在二代测序出来之前被认为是FISH（荧光原位杂交）。因此所有的基因融合的分子病理检测结果都需要和FISH金标准进行对比，如果结果吻合，那么证明结果是可靠的，如果不吻合，也不能说这个技术比金标准更好，因为金标准被假设为就是准确的。

有什么方法可以替代金标准？只有一个方式，首先金标准认为正确的，新技术的检测也必须百分之百正确。第二，在金标准无法检验的情况下，新技术还有办法检验出来。也就是说，新技术的检测结果必须要和金标准的结果吻合，还必须做得更好，在方法学上是相对保守的。

能够取代金标准FISH的AMP技术

下面给大家介绍一篇文章。从学术上来说这是一篇很老的文章了，是2014年发表，研究从2011年就开始，到现在差不多6年时间了。这篇文章的名字叫做《Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing》，发表在《Nature Medicine》上，介绍了一种分子病理检测的方法，用二代测序的方法检测基因融合。可以看到注释中说明，这项技术的临床灵敏度达到了百分之百，临床的特异性达到了百分之百。这两个百分之百是用FISH为金标准来判定的，也就是说，FISH认为是阳性的，这个技术也判断为阳性，FISH认为是阴性的，该技术也判断为阴性。此外要注意的一点是，这项技术比FISH更好的指标是检测的成功率是97%，这是临床上986份样本的实测数据，甚至包括了保存超过5年以上的石蜡切片样本。

这里需要介绍一下恒特基因的首席科学家郑宗立博士，他是我在哈佛医学院麻省总医院四年的同事，刚才的文章是他的代表作品，他是第一作者，文章最后一个作者是John Iafrate教授，麻省总医院分子病理科的主任。John Iafrate教授对这个方法学感受很深，因为FDA的FISH检测ALK基因融合的指南就是他编写的。

基于二代测序技术的AMP方法出现之前他还发明了一个PCR方法用于检测点突变。这两个方法当时在分子病理实验室里一直使用，AMP发明之后半年之内他就决定把之前两个方法淘汰掉，哈佛医学院麻省总医院已经完全使用AMP方法进行肿瘤基因的分子病理检测，但是FDA一直没有进行更改。AMP技术已于2013年由哈佛麻省总医院向美国专利局提交专利申请，2016年11月拿到了授权。该专利的所有人是麻省总医院，独家授权给了Archer DX公司使用，这家公司也是我们的合作伙伴。

下面我介绍下FISH和AMP各自的特点。大家对FISH非常熟悉，左边这张片子主要是通过人工来判读点的颜色，来判断是否发生了基因融合。当然这有一个先决条件，一般情况下你必须预先限定可能发生融合的两个基因是什么，比如EML4-ALK这个融合，对EML4做一个标记，对ALK做一个标记，如果发生融合了就会变成橙色，如果不知道是ALK跟别的什么基因发生融合，那就比较难以判断了。同时，对基因的融合断点的分辨率也非常差，还有一个缺点是需要进行人工判读，很容易出错并且非常繁琐，培养一个能够准确判读片子的病理学家也非常耗时间。

我们来看一下AMP技术的做法。这个技术能够一次把各种基因的组合做成一个Panel，可以检测几个到几十个基因，对感兴趣的基因进行靶向测序，发现哪一段未知基因序列和ALK基因发生融合，可以在分子水平甚至在单个的碱基位置水平上有一个非常确凿的证据，并且全过程可以用计算机算法来解决，证据非常明确，不需要人工的主观经验判断。

既然FISH已经是金标准，那么AMP就必须和FISH方法进行比较。我们比较了四个基因：ALK、ROS1、RET、PPARG的融合现象。与标准的检测方法FISH相比较，AMP显示出其在临床灵敏度和特异性方面的优越性能。使用针对23个目标基因的RNA检测方法检测从56例FISH检测呈阳性的FFPE样本，结果均为阳性，临床灵敏度为100% (95% CI：96.5%-100% ) 。检测273例FISH检测呈阴性的样本，结果均为阴性，临床灵敏度为100% (95% CI：99.3%-100% ) 。

这也说明，第一AMP和FISH百分之百吻合。第二AMP比FISH更好，有些FISH无法判断的疑难案例，AMP都做了非常准确的判断。

刚才还谈到FISH的缺陷，比如对新型的基因融合类型无法判断，它并不能发现一个基因和另外哪些未知基因发生融合，对融合断点的判断也非常困难，所以一般只能用来检测已知的基因融合。

AMP对新型基因融合的发现能力非常强，在这篇文章中发现ROS1有很多新型的融合断点，包括和其他一些基因的重排。这些在临床病理上的意义是非常显著的。

我们知道ALK基因刚开始被发现有融合的时候，当时发现人群中的突变比例大约是略超过1%。所以，当初开发针对ALK靶向药克唑替尼的时候就比较犹豫。现今ALK重排占到了4%到5%之间，比当初发现的时候高出了很多，对病人、医生以及药物研发企业来说是非常有利的现象，所以新型基因融合的发现不要简单认为只是学术上的内容，对临床和经济及社会方面的作用也非常明显。

这张幻灯片介绍了ASCO2107上发表的关于新药LOXO－101与NTRK基因融合突变的内容，进一步证明了发现新型基因融合的意义。关于LOXO－101的临床试验对NTRK1/2/3三个基因进行了“篮子试验”，并不需要事先知道是非小细胞肺癌或者是其他癌种，只要是NTRK融合的阳性就可以进入药物试验。这时候和传统的病理方法就完全颠倒过来了，更多的是采用分子检验和分子分型来进行治疗。

AMP可以对多种突变类型进行检测，这里强调的是AMP方法对点突变和插入、缺失的检测，主要是使用了单分子标签（MI）的方法，这个单分子标签的方法最近炒得很火热，其实在五年前，我们就已经很成熟地运用了。MI这个技术是用来消除测序、扩增过程中的误差，不使用MI技术的话，检测的特异性或者是准确度可能达不到2%或者是3%以下，如果使用了MI的技术，理论上准确度可以提高一个数量级。片子的左边是对点突变的检测，有一些随机出现的错误点，用这个方式排除掉，得出一个可靠的点突变结论。右边是EGFR第19号外显子的缺失，这个我就不多解释了，很明显这里缺了一个口，所有人可以看出来。

这里是拷贝数的变异，以KRAS基因为例，使用了初始拷贝数和单分子标签还原拷贝数的变化，可以看出KRAS相对于整个基因组是否进行了扩增。

再往下是RNA表达，与表达芯片结果进行比较，结果基本一致。也就是说，使用AMP的方法可以对所有的变异类型进行检测，包括点突变、插入缺失，包括拷贝数变异、基因融合、RNA表达。这个方法的功能非常强大，临床上的意义也非常明显，作为一个医生或者作为病人来说，最怕的是等了很多天之后，被告知没有检出什么结果来，他会问是什么原因。我们只能老老实实告诉他，有的检测项目并没有做，比如只是检测了融合，没有检测点突变。这对病人来说是不可接受的，他们肯定希望有一个一站式的解决方案，一个检测基本上把大多数变异的类型全都检测出来。

刚才说的Archer DX是一家总部位于科罗拉多的公司，也是恒特基因的战略合作伙伴，各位专家可以看看这家公司的发展历史。

2011年恒特基因首席科学家郑宗立博士开发了AMP技术，2013年Archer DX创立，从麻省总医院获得AMP专利授权，2014年基于AMP技术推出系列产品，2016年与Illumina合作进行FDA的临床注册和市场推广，2017年与恒特基因携手进入中国市场。这是Archer DX公司的试剂盒产品，操作非常简便，可以像一个机械手一样按部就班的进行操作，不容易出错。

目前Archer基于AMP技术有两大类的产品，一种是FUSIONPlex，基于RNA模版，主要是检测基因融合和RNA的表达变异。还有一个是VARIANTPlex，可以检测DNA拷贝数的变异和点突变、插入缺失。大多数的产品还是使用石蜡切片。最近也推出了ctDNA液体活检的产品。

AMP技术的“升级版”——PANO-Seq^TM

作为一个技术人员，实际上对开发自己的技术更感兴趣，AMP推出已经有五年了，在美国使用非常广泛也非常成熟，作为我和郑博士来说，我们的兴趣是致力于推出更新一代的技术和产品，这是我们创立恒特基因的目的。

我给大家介绍一下新一代的技术PANO-Seq^TM（Parallel Amplification Numerically Optimized Sequencing，平行扩增数字优化测序）。它主要是为了解决两个方面的问题。首先是平行扩增，可以达到检测更多基因，甚至几百个基因这样的一个大型Panel。第二是满足液体活检的更高灵敏度和特异度，为了贴合这两个特点我们将其命名为平行扩增数字优化，简称PANO-Seq^TM全景测序。

PANO-Seq^TM有许多优势，一方面是模块化设计。临床病理样本多种多样，有可能是组织切片、石蜡切片、穿刺样本，也有可能是全血或者血浆。所以在开发产品过程中，用了模块化的方法，首先做了RNA的模块，然后做了组织DNA模块、编码模块、多重扩增模块，从产品角度来说，或者从用户使用角度来说，可以根据不同的样本类型决定从哪一个模块开始做，这是第一个特点。

第二，是全能型的设计。AMP可以检测五种变异类型，但实际上在使用过程中是把DNA和RNA两个模板分别进行处理，对RNA模板检测的是两种突变类型，即RNA融合和表达，对DNA是三种突变，点突变，插入/缺失以及拷贝数，是一个并行的操作流程，到最后再进行合并。但我们认为这个过程太繁琐了，还不如一次全部完成。所以，我们的方法在同一管中进行反应，可以进行DNA拷贝数、点突变、插入和缺失、RNA表达和融合的检测，全面精简了操作时间和工作量，数据的质量也更高，所以合并操作是在使用及性能方面是非常有利的。

刚才说的模块化就体现在操作流程上，左边是组织样本的组合，是DNA+RNA的建库流程，首先进行核酸的处理，然后是扩增处理，然后进行扩增，最后是测序，总体操作时间大概是10个小时。为了使用方便，我们把它拆分成两天，第一天开始收样进行操作，有一部分反应是做过夜的，第二天完成剩余步骤，当天中午到下午就可以上机测序。

右边ctDNA的操作过程更短一些，不需要做RNA的前处理，节省了大约3个小时，如果要压缩的话可以在6到7个小时完成，但是为了更人性化，我们还是拆分成两天操作。在座的可能很多都使用过杂交捕获法，这也是目前的主流，目前的基因检测公司大多数都使用这种方法。不知道大家有没有实际操作过，很多人实际操作过觉得操作时间太长，受不了，我们是按小时计算的，而杂交捕获法的时间是三天三夜的连续操作。

这是我们和一家合作单位进行的30多例样本检测，各种样本前后有4到5个技术人员操作过，有些人员是第一次接触二代测序，30多个样本最后测出来是百分之百成功。这里的结果可以给大家汇报一下，主要的突变是在TP53和EGFR。大家都知道EGFR的突变在非小细胞肺癌中，东亚人群占比大约50%。我们感兴趣的是，发现了三例是基因融合，其中两例是EML-ALK融合，这两例融合是不同的亚型，第一例是EML4在第17外显子和ALK第20外显子的融合，第二例是EML4的第4号外显子和ALK的第20号外显子的融合，使用PANO-Seq^TM不仅可以确定突变的丰度，也可以把融合所发生的位置确定出来。第三例是比较少见的RET基因融合。

谈一下PANO-Seq^TM的技术性能，我们使用了Horizon DX标准品进行了评估，这个标准品有43个突变，这些突变是点突变或者是插入/缺失的突变。突变中有4个是中高频率，大概是8%左右，39个是低频的，1%。使用50纳克的起始核酸，这个量是中等偏低的程度，位点灵敏度是100%，43个突变以及39个低频突变完全检出。特异性也是100%，标准品没有的突变也没有检测出来，假阳性率是0。

这个是PANO-Seq^TM和行业上鼎鼎有名的扩增法主要厂家的Ampli-Seq Panel进行对比。左边是标准品公司Horizon网站上的截图，在三个不同实验室使用了两种不同的Panel进行了检测，在表格上可以看到， Ampli-Seq最少的样本量10纳克，但其实有好几个突变是用红色标记没有检测出来，漏检了很多。右边是恒特基因做的PANO-Seq^TM的6个实验，前三个是使用了50纳克的核酸，右边是使用了10纳克的核酸。一个纳克的核酸有330个基因组，10个纳克有3300个基因组。在右边有一个比较小的标记，是表示单分子去重后的有效测序深度，这表示使用PANO-Seq方法，3300个分子回收了1900个，回收率是60%左右，这是早期实验的结果，目前的回收率更高。

右边是我们产品的性能参数表，如果使用组织核酸的话，最小的核酸用量是10纳克，如果是ctDNA可以低到5纳克。对DNA的质量要求也比较低，大家都知道ctDNA降解很厉害；另外病理科的石蜡切片放了几年的都有，他们也不会考虑DNA和RNA的降解问题，AMP法能够检测在常温条件下放了多年的石蜡切片。还有是检测灵敏度，如果是病理组织1%左右足够了，低于4%临床医生可能不会根据这个进行用药指导。更优的灵敏度对ctDNA检测来说是有意义的，因为血浆中的ctDNA比较低。操作时间也比较短，以小时计，当中的手工操作时间大概是2到3个小时之间。

一个检测方法，除了要有实验流程，还需要有很强大的算法进行支持。我们开发了一整套的软件，我们会把软件放在云上面，测序的数据直接输入到云平台，在数个小时之后可以得到检测结果。在后端有算法引擎，还有人工智能学习的功能，对结果进行积累和反馈。